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Le cellule tumorali hanno sviluppato vari meccanismi per superare lo stress cellulare e continuare a progredire.La proteina chinasi R (PKR) e il suo attivatore proteico (PACT) sono i primi responder che monitorano vari segnali di stress che portano all'inibizione della proliferazione cellulare e dell'apoptosi.Tuttavia, la regolazione del percorso PACT-PKR nelle cellule tumorali rimane in gran parte sconosciuta.Qui, abbiamo scoperto che il lungo RNA non codificante (lncRNA) aspartil tRNA sintetasi RNA antisenso 1 (DARS-AS1) è direttamente coinvolto nell'inibizione del percorso PACT-PKR e promuove la proliferazione delle cellule tumorali.Utilizzando lo screening funzionale su larga scala dell'lncRNA associato al cancro CRISPRi 971, abbiamo scoperto che DARS-AS1 era associato a una proliferazione delle cellule tumorali significativamente migliorata.Pertanto, il knockout DARS-AS1 inibisce la proliferazione cellulare e promuove l'apoptosi delle cellule tumorali in varie linee cellulari tumorali in vitro e riduce significativamente la crescita del tumore in vivo.Meccanicamente, DARS-AS1 si lega direttamente al dominio di attivazione PACT e previene l'interazione PACT-PKR, riducendo così l'attivazione di PKR, la fosforilazione di eIF2α e inibendo la morte cellulare apoptotica.Clinicamente, DARS-AS1 è ampiamente espresso in più tumori e la sovraespressione di questo lncRNA è indicativa di una prognosi sfavorevole.Questo studio chiarisce la regolazione specifica del cancro del percorso PACT-PKR da parte di DARS-AS1 lncRNA e fornisce un altro obiettivo per la prognosi e il trattamento del cancro.
La capacità di adattarsi allo stress è una caratteristica importante della sopravvivenza e della proliferazione delle cellule tumorali.La rapida proliferazione e le caratteristiche metaboliche del cancro raggiungono il picco in microambienti difficili - deprivazione di nutrienti, ipossia e basso pH - che possono innescare vie di segnalazione della morte cellulare.La disregolazione dei geni sensibili allo stress come p535, proteine ​​​​da shock termico 6, 7, KRAS8, 9 e HIF-110, 11, 12, 13 è spesso osservata nel cancro, bloccando così l'apoptosi e promuovendo la sopravvivenza.
La protein chinasi R (PKR) è un importante sensore di stress e subunità chinasi del fattore di iniziazione eucariotica 2α (eIF2α), un regolatore traslazionale che collega lo stress cellulare alla morte cellulare.PKR è stato originariamente identificato come una proteina antivirale dalla rilevazione di un RNA a doppio filamento estraneo (dsRNA).Dopo l'attivazione, PKR fosforila eIF2α per inibire la sintesi proteica virale e cellulare14,15,16.PACT (PKR activator protein) è stata identificata come la prima proteina attivatrice PKR in assenza di dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Attraverso l'interazione diretta con PKR, PACT trasduce vari stress (fame di siero, trattamento con perossido o arsenito) in PKR e vie di segnalazione a valle.Oltre alla fosforilazione di eIF2α, l'attivazione PKR mediata da PACT innesca vari eventi associati alla risposta allo stress, incluso lo stato redox alterato tramite il percorso PI3K/Akt24, il controllo del danno al DNA migliorato tramite p5325,26 e NF-κB27,28 Regola la trascrizione, 29. Dato il loro ruolo critico nella risposta allo stress, nella proliferazione, nell'apoptosi e in altri processi cellulari chiave, PKR e PACT sono promettenti bersagli terapeutici per molte malattie, in particolare il cancro30,31,32,33.Tuttavia, nonostante questo significato funzionale e biologico pleiotropico, la regolazione dell'attività PACT/PKR nelle cellule tumorali rimane sfuggente.
Gli lncRNA sono trascritti più grandi di 200 nucleotidi senza potenziale codificante per le proteine.Poiché progetti all'avanguardia di sequenziamento dell'intero genoma hanno identificato migliaia di lncRNA,35,36 sono stati compiuti molti sforzi per chiarire le loro funzioni biologiche.Un numero crescente di ricerche ha dimostrato che gli lncRNA sono coinvolti in molti processi biologici37 tra cui la regolazione dell'inattivazione del cromosoma X38,39, l'imprinting40, la trascrizione41,42, la traduzione43 e persino la crescita del cancro44,45,46,47.Questi studi hanno riportato che molti lncRNA sono coinvolti nel percorso PACT/PKR.Uno di questi studi ha mostrato che lncRNA ASPACT inibiva la trascrizione di PACT e aumentava la ritenzione nucleare dell'mRNA di PACT.Altri studi hanno dimostrato che lncRNA nc886 si lega al PKR e ne inibisce la fosforilazione49,50.Finora, l'attivazione di PKR mediata da PACT regolante lncRNA non è stata segnalata.
L'antisenso RNA 1 dell'aspartil-tRNA sintetasi (DARS-AS1) è stato identificato come lncRNA51,52,53,54 oncogenico.Attraverso la regolazione di miP-194-5p53, miP-12952 e miP-532-3p51, DARS-AS1 ha dimostrato di promuovere la crescita di carcinoma renale a cellule chiare, carcinoma tiroideo e carcinoma polmonare non a piccole cellule, rispettivamente.Tong e colleghi hanno anche scoperto che DARS-AS1 promuove la progressione del mieloma mantenendo la stabilità del motivo di legame dell'RNA della proteina 39 (RBM39).Tuttavia, non sono stati condotti studi sul fatto che questo lncRNA sia coinvolto nella regolazione dell'attivazione di PACT-PKR e nella risposta allo stress delle cellule tumorali.
Qui, abbiamo eseguito uno schermo di perdita di funzione su larga scala utilizzando il sistema CRISPRi e abbiamo determinato che DARS-AS1 lncRNA promuove la proliferazione di diversi tipi di cellule tumorali.Inoltre, abbiamo identificato un meccanismo importante: DARS-AS1 si lega direttamente al PACT, inibisce il legame PACT e PKR, previene la fosforilazione di eIF2α, un substrato PKR inferiore e, infine, inibisce la morte cellulare apoptotica.In conclusione, il nostro lavoro rivela l'lncRNA DARS-AS1 come un regolatore del percorso PACT-PKR e un potenziale bersaglio per il trattamento e la prognosi del cancro.
Ampi studi di profilazione genomica hanno identificato centinaia di lncRNA associati al cancro.Tuttavia, la loro funzione rimane in gran parte sconosciuta56.Per identificare promettenti candidati lncRNA coinvolti nella progressione del cancro, abbiamo eseguito uno screening della perdita di funzione per una ridotta proliferazione nella linea cellulare di cancro colorettale SW620 utilizzando il sistema CRISPRi (Fig. 1a).La caratteristica unica delle linee cellulari di cancro del colon SW480 e SW620 è che derivano da tumori primari e secondari in un singolo paziente.Ciò fornisce un prezioso confronto per lo studio dei cambiamenti genetici nella progressione del cancro del colon avanzato.Pertanto, abbiamo analizzato i trascrittomi delle linee cellulari di cancro del colon-retto (SW480 e SW620) utilizzando il sequenziamento dell'RNA e raccolto alcuni potenziali lncRNA funzionali dalla letteratura pubblicata.Sulla base di questi risultati, abbiamo progettato una libreria di sgRNA in pool contenente 7355 oligo di sgRNA mirati a 971 lncRNA associati al cancro e 500 oligo di sgRNA non mirati per un controllo negativo (dati supplementari 1).
Rappresentazione schematica dello screening con il sistema CRISRi.b Arricchimento di sgRNA dopo lo screening.La linea tratteggiata orizzontale rappresenta log2 (cambio piega) = ±0,58.La linea tratteggiata verticale indica il valore p = 0,05.I punti neri rappresentano sgRNA non target (designato come NC).I punti rossi sono sgRNA che prendono di mira DARS-AS1.I punti blu sono sgRNA che prendono di mira LINC00205, un lncRNA oncogenico precedentemente descritto.cambio piega = (lettura normalizzata, giorno 17)/(lettura normalizzata, giorno 0).c Il knockdown dell'sgRNA DARS-AS1 ha inibito la crescita cellulare.Le barre di errore rappresentano ± deviazione standard dei tre esperimenti.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 t-test di Student a due code.d Espressione DARS-AS1 nei tumori (set di dati TCGA).em Espressione di DARS-AS1 in campioni accoppiati normali e tumorali di pazienti con BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP e COAD, rispettivamente (set di dati TCGA).i valori p sono stati ottenuti utilizzando il test t di Student accoppiato a due code.
Dopo aver costruito il plasmide e confezionato il lentivirus, abbiamo trasdotto la linea cellulare di cancro colorettale dCas9-SW620 con la libreria di cui sopra in quattro esperimenti di infezione indipendenti.La molteplicità delle infezioni (MOI) per queste infezioni era 0,1–0,3, indicando che ogni cellula può essere trasfettata solo con un sgRNA.Dopo 18 giorni di coltura in vitro, il profilo di arricchimento degli sgRNA target è diminuito o aumentato dopo lo screening, mentre il numero di oligonucleotidi di controllo non mirati è rimasto relativamente invariato rispetto al profilo di pre-screening, indicando che il nostro target ha un'elevata specificità dello schermo biblioteca.Riso.1b e tabella integrativa 1). LINC00205, che in precedenza era stato segnalato per promuovere il cancro ai polmoni e la progressione del cancro al fegato58,59,60, è stato escluso (log2 (foldchange) <-0,58, valore p <0,05), confermando l'affidabilità di questo screening (Fig. 1b). LINC00205, che in precedenza era stato segnalato per promuovere il cancro ai polmoni e la progressione del cancro al fegato58,59,60, è stato escluso (log2 (foldchange) <-0,58, valore p <0,05), confermando l'affidabilità di questo screening (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, precedentemente segnalato per promuovere la progressione del cancro del polmone e del cancro del fegato58,59,60, è stato escluso (log2 (cambiamento di piega) <-0,58, valore p <0,05), confermando la robustezza di questo screening (Fig. 1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0.58 ， P 值 <0,05） ， ， 证实 了 该 筛选 的 （（图 1B））） Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0.58 ， P 值 <0,05） ， ， 证实 了 该 筛选 的 （（图 1B））） LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, precedentemente segnalato per promuovere la progressione del cancro del polmone e del fegato58,59,60, è stato escluso (log2 (cambiamento di piega) <-0,58, p-value <0,05), confermando la robustezza di questo screening (Fig. .1b).
Tra tutti gli lncRNA testati, è stato anche proiettato DARS-AS1, con i tre oligonucleotidi sgRNA affini significativamente ridotti dopo 18 giorni di coltura, suggerendo che il knockdown di questo lncRNA ha comportato una ridotta proliferazione del cancro (Fig. 1b).Questo risultato è stato ulteriormente supportato dall'analisi MTS nelle cellule tumorali del colon-retto, mostrando che il tasso di crescita delle cellule knockdown DARS-AS1 era solo dimezzato rispetto alle cellule di controllo (Figura 1c) ed era coerente con i precedenti rapporti di diversi altri tipi di cancro.: carcinoma renale a cellule chiare, carcinoma tiroideo e carcinoma polmonare non a piccole cellule51,52,53,55.Tuttavia, la sua funzione e i meccanismi molecolari nel cancro del colon-retto rimangono inesplorati.Pertanto, abbiamo scelto questo lncRNA per ulteriori studi.
Per studiare l'espressione DARS-AS1 nei pazienti, abbiamo analizzato in modo completo 10.327 campioni di tumore dal progetto Cancer Genome Atlas (TCGA).I nostri risultati mostrano che DARS-AS1 è ampiamente espresso e significativamente sovraregolato nelle cellule sane in una varietà di tumori, tra cui l'adenocarcinoma del colon (COAD), il carcinoma renale a cellule chiare (KIRC) e il carcinoma a cellule papillari renali (KIRP)..Pochissimi (Fig. 1d e Fig. 1a, b). L'analisi di campioni accoppiati sani/tumorali ha ulteriormente confermato un'espressione significativamente più elevata di DARS-AS1 nei tumori del carcinoma uroteliale della vescica (BLCA), carcinoma renale renale a cellule chiare (KIRC), adenocarcinoma prostatico (PRAD), carcinoma a cellule squamose del polmone (LUSC) , carcinoma endometriale del corpo uterino (UCEC), adenocarcinoma polmonare (LUAD), carcinoma epatocellulare del fegato (LIHC), carcinoma renale renale a cellule papillari (KIRP) e adenocarcinoma del colon (COAD) (valore p <0,05) (Fig. 1e-m) . L'analisi di campioni accoppiati sani/tumorali ha ulteriormente confermato un'espressione significativamente più elevata di DARS-AS1 nei tumori del carcinoma uroteliale della vescica (BLCA), carcinoma renale renale a cellule chiare (KIRC), adenocarcinoma prostatico (PRAD), carcinoma a cellule squamose del polmone (LUSC) , carcinoma endometriale del corpo uterino (UCEC), adenocarcinoma polmonare (LUAD), carcinoma epatocellulare del fegato (LIHC), carcinoma renale renale a cellule papillari (KIRP) e adenocarcinoma del colon (COAD) (valore p <0,05) (Fig. 1e-m) .L'analisi di campioni accoppiati sani/tumorali ha anche confermato un'espressione significativamente più elevata di DARS-AS1 nei tumori del carcinoma uroteliale della vescica (BLCA), del carcinoma renale e renale a cellule chiare (KIRC), dell'adenocarcinoma prostatico (PRAD), del carcinoma a cellule squamose del polmone (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , carcinoma endometriale del corpo uterino (UCEC), adenocarcinoma del polmone (LUAD), carcinoma epatocellulare del fegato (LIHC), carcinoma a cellule papillari del rene (KIRP) e adenocarcinoma del colon (COAD) (valore p < 0,05) (Fig. 1e–m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (blca) 、 肾 肾 透明 细胞癌 (kirc) 、 前列 腺腺癌 (prad) 、 肺鳞状 细胞癌 (lUSC) 肿瘤 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （UCEC） ， 肺腺癌 （Luad） ， 肝肝 细胞癌 （liHC） ， 肾 肾 乳头状 细胞癌 （KIRP） 和结肠腺癌 （coad） （P 值<0,05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 前列 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 更 高 表达 内膜 癌 （（Ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 乳头状 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .L'analisi di campioni accoppiati sani/tumorali ha ulteriormente supportato il ruolo di DARS-AS1 nei tumori del carcinoma uroteliale della vescica (BLCA), del carcinoma a cellule renali a cellule chiare (KIRC), dell'adenocarcinoma prostatico (PRAD) e del carcinoma a cellule squamose del polmone (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). espressione nel carcinoma del corpo uterino (UCEC), adenocarcinoma polmonare (LUAD), carcinoma epatocellulare (LIHC), carcinoma a cellule papillari renali (KIRP) e adenocarcinoma del colon (COAD) (valore p <0,05) (Figura 1e -m).Presi insieme, questi risultati indicano che DARS-AS1 è ampiamente e altamente espresso in una varietà di tumori.
Poiché DARS-AS1 e DARS (il gene che codifica per il filamento antisenso) condividono lo stesso promotore e si trovano uno accanto all'altro, abbiamo progettato shRNA per abbattere specificamente DARS-AS1 ma non DARS (Figura 2a, b supplementare e Tabella 2 supplementare) .Oltre a SW620, abbiamo utilizzato anche altre tre linee cellulari che esprimono altamente DARS-AS1 per studiare l'efficacia e la funzione del knockdown dello shRNA (Tabella supplementare 3).I nostri risultati hanno indicato che tutti e tre gli shRNA sviluppati hanno raggiunto almeno l'80% di efficienza di abbattimento DARS-AS1 con scarso effetto sulla quantità di mRNA DARS (Figura 2c-f supplementare).Inoltre, abbiamo scoperto che il knockdown DARS-AS1 con questi shRNA ha inibito significativamente la crescita cellulare nelle linee cellulari di cancro del colon-retto SW620 (49,7%) e HCT116 (27,7%), la linea cellulare di cancro al seno MBA-MD-231 (53,4%).) e la linea cellulare dell'epatoma HepG2 (riduzione del 92,7%), nonché la loro capacità di formare sfere non ancorate (riduzione media di ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% e 75,7% per linea cellulare) (Fig. 2a, b).In SW620, i risultati del test di formazione delle colonie hanno ulteriormente confermato che lo shRNA DARS-AS1 ha inibito significativamente la proliferazione cellulare con una diminuzione media di circa il 69,6% (Fig. 2c).
Effetto dello shRNA di controllo e dello shRNA DARS-AS1 sulla proliferazione cellulare (a) e sulla formazione di sferoidi (b) nelle cellule SW620, HCT116, MBA-MD-231 e HepG2.c Effetto dello shRNA di controllo e dello shRNA DARS-AS1 sulla formazione di colonie nelle cellule SW620.Proliferazione cellulare (d), formazione di sferoidi (e) e formazione di colonie (f) di cellule SW620 che sovraesprimono DARS-AS1.I dati mostrati sono la media ± deviazione standard di tre esperimenti.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 e *** p ≤ 0,001 dal test t di Student a due code.
Per completare gli studi sulla perdita di funzione, abbiamo quindi creato cellule SW620 che sovraesprimono DARS-AS1 (Figura 2g supplementare).La sovraespressione di DARS-AS1 ha aumentato significativamente la crescita cellulare (1,8 volte), la formazione di sferoidi non ancorati (1,4 volte) e la formazione di colonie (3,3 volte) nelle cellule SW620 (Fig. 2d-f).Abbiamo confermato questo risultato utilizzando un'altra linea cellulare che esprime DARS-AS1, A549.Questa maggiore proliferazione cellulare dovuta alla sovraespressione DARS-AS1 è stata ulteriormente osservata nelle cellule A549 (Figura 2h supplementare, i e Tabella 3 supplementare).Presi insieme, questi studi di guadagno e perdita dimostrano che DARS-AS1 promuove la proliferazione delle cellule tumorali in vitro.
Per esplorare il meccanismo alla base con cui DARS-AS1 regola la proliferazione cellulare, abbiamo eseguito un'analisi di pull-down dell'RNA per identificare i suoi potenziali partner di legame alle proteine.I risultati di RT-qPCR hanno mostrato che circa l'86,2% di DARS-AS1 si trova nel citoplasma delle cellule SW620 (Figura 3a supplementare).Il DARS-AS1 o pseudoRNA biotinilato trascritto in vitro è stato quindi incubato con lisati cellulari SW620 seguiti da separazione SDS-PAGE.La successiva colorazione con argento ha mostrato che una banda distinta (~ 38 kDa) era significativamente arricchita nei campioni di pull DARS-AS1 ma non in campioni fittizi di RNA o perline (Fig. 3a).Questa banda è stata identificata come una proteina attivante PKR (PACT) mediante spettrometria di massa (MS) e ulteriormente confermata mediante immunoblotting nelle linee cellulari SW620, HCT116 e HepG2 (Fig. 3a, b).L'arricchimento di DARS e delle relative proteine ​​PACT - PKR e TRBP - è stato anche studiato utilizzando l'analisi dell'RNA mediante Western blotting (WB).I risultati hanno indicato che non è stata trovata alcuna interazione diretta tra l'RNA DARS-AS1 e queste tre proteine ​​(Figura 3b supplementare).L'interazione specifica tra DARS-AS1 e PACT è stata ulteriormente confermata dall'analisi dell'immunoprecipitazione dell'RNA (RIP), che ha mostrato che DARS-AS1 era significativamente arricchito in anticorpi anti-PACT ma non in altri RNA di controllo (Figura 3c).Per determinare se DARS-AS1 interagisce direttamente con PACT in assenza di altri componenti cellulari, è stato eseguito un test di interferometria biostrato in vitro (BLI) utilizzando PACT purificato.DARS-AS1 marcato con biotina o RNA fittizio sono stati immobilizzati su biosensori di streptavidina (SA) e quindi incubati in un tampone cinetico contenente 1 μM di PACT.In particolare, PACT si legava fortemente a DARS-AS1 (valore KD ~ 26,9 nM), ma non per imitare l'RNA (Figura 3d).Presi insieme, questi risultati dimostrano un'interazione diretta e un'elevata affinità tra DARS-AS1 e PACT.
L'analisi pull dell'RNA ha identificato DARS-AS1 che interagisce con PACT nelle cellule SW620.Sopra, colorazione con argento di proteine ​​correlate.Gli immunoblot inferiori sono stati eseguiti con anticorpi anti-PACT.b L'analisi del pull-down dell'RNA è stata eseguita nelle cellule HCT116 (in alto) e HepG2 (in basso).L'arricchimento del PACT è stato rilevato mediante immunoblotting.I saggi di immunoprecipitazione del cRNA (RIP) sono stati eseguiti in cellule SW620 utilizzando gli anticorpi indicati.d Le curve di legame PACT a DARS-AS1 a lunghezza intera o RNA di controllo sono state ottenute utilizzando l'interferometria del biostrato (BLI).L'RNA è stato immobilizzato su un biosensore di streptavidina.1 μM PACT è stato utilizzato per misurare l'associazione.e Il test di pull dell'RNA è stato eseguito utilizzando DARS-AS1 a lunghezza intera biotinilato o troncato (in alto).Immunoblot che mostra PACT ricevuto (in basso).f Il PACT contrassegnato purificato è stato incubato con DARS-AS1 a lunghezza intera biotinilato o troncato (come in e) per il test RIP in vitro.L'RNA estratto è stato verificato mediante RT-qPCR.g L'affinità relativa di diversi frammenti di RNA per PACT è stata ottenuta utilizzando l'interferometria del biostrato.Per l'analisi sono stati utilizzati 100 nM RNA e 1 μM RAST.h I saggi RIP in vitro sono stati eseguiti utilizzando PACT etichettato intatto o troncato purificato.L'RNA estratto è stato verificato mediante RT-qPCR.i Tasso di crescita delle cellule SW620 che sovraesprimono DARS-AS1, PACT o entrambi.j La sovraespressione di DARS-AS1 a lunghezza intera o troncata nelle cellule SW620 ha avuto effetti diversi sulla crescita cellulare.k L'apoptosi è stata rilevata mediante immunoblotting con anticorpi anti-PARP.l Il knockout di DARS-AS1 induce l'apoptosi delle cellule SW620 come mostrato dalla citometria a flusso.I dati mostrati sono la media ± deviazione standard di tre esperimenti. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, dal test t di Student a due code. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, dal test t di Student a due code. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 dal test t di Student a due code. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 dal test t di Student a due code.
Abbiamo quindi generato tre frammenti di RNA DARS-AS1 biotinilati mediante trascrizione in vitro per identificare la regione DARS-AS1 richiesta per l'associazione PACT (Figura 3e).I risultati dell'analisi dell'RNA hanno mostrato che ogni frammento era in grado di interagire con PACT, ma la regione 3'-terminale (384–768 nucleotidi etichettati A3) mostrava più di 1–384 nucleotidi etichettati A1) (Fig. 3e).Risultati simili sono stati osservati nel test RIP in vitro utilizzando PACT ricombinante (Figura 3f).Coerentemente con questi risultati, gli esperimenti per legare frammenti di RNA immobilizzati a PACT utilizzando BLI hanno anche mostrato che PACT ha una maggiore affinità per A3 (384–768 nt) (valore KD di circa 94,6 nM), mentre quasi nessun collegamento con altre aree.(Fig. 3d).
Abbiamo anche esaminato le regioni di legame associate in PACT.PACT contiene tre domini funzionali, due dei quali sono domini di legame dell'RNA a doppio filamento (dsRBD) e un terzo dominio (designato D3) che agisce come attivatore delle interazioni proteiche.Per esaminare la capacità di legame lncRNA di ciascun dominio, abbiamo progettato tre mutazioni che hanno rimosso ciascuno dei tre domini ed eseguito un test RIP in vitro.I nostri risultati hanno mostrato che l'eliminazione del terzo dominio (D3) di PACT ha ridotto significativamente la sua interazione con DARS-AS1 (di 0,11 volte rispetto a PACT intatto) rispetto alle altre due mutazioni (Fig. 3h), è stato dimostrato che il rilascio di D3 ha interagito con DARS.-AC1.Presi insieme, questi risultati suggeriscono che l'interazione tra DARS-AS1 e PACT può verificarsi principalmente attraverso l'estremità 3' di DARS-AS1 e il dominio D3 di PACT.
Abbiamo notato che DARS-AS1 non ha avuto alcun effetto sull'espressione PACT e PACT non ha avuto alcun effetto su DARS-AS1 (Figura 3c supplementare).Abbiamo quindi esaminato l'effetto del knockdown PACT sulla crescita cellulare.Contrariamente a DARS-AS1, le cellule relative sono cresciute 1,5-3 volte più velocemente quando PACT è stato abbattuto (Figura 3d supplementare).I risultati del test di formazione delle colonie hanno indicato che le cellule formavano colonie di 2-3 volte dopo il trattamento con shRNA con PACT (Figura 3e supplementare).Per verificare se DARS-AS1 regola la proliferazione cellulare attraverso PACT, abbiamo generato cellule SW620 che sovraesprimono PACT, DARS-AS1 o entrambi.La sovraespressione di PACT ha mostrato una significativa inibizione della proliferazione cellulare (Figura 3i).Mentre la sovraespressione di DARS-AS1 di per sé ha promosso significativamente la proliferazione cellulare, non c'era alcuna differenza significativa nel tasso di crescita delle cellule che sovraesprimono DARS-AS1 e PACT.Questi risultati suggeriscono che PACT può contrastare l'aumento della proliferazione causata dalla sovraespressione di DARS-AS1.
Poiché diverse regioni di DARS-AS1 hanno diverse capacità di legame PACT, abbiamo studiato la loro influenza relativa sulla proliferazione cellulare mediante la diversa sovraespressione dei frammenti DARS-AS1.Rispetto agli altri due frammenti, DARS-AS1 era sovraespresso all'estremità 3 '(384–768 nt), la principale regione correlata a PACT in DARS-AS1, che aveva la più alta capacità di stimolare la proliferazione cellulare (Fig. 3j).Questi risultati indicano una correlazione positiva tra la capacità di legame e la funzione biologica di DARS-AS1.
È stato segnalato che PACT è una proteina pro-apoptotica19.Pertanto, abbiamo studiato l'effetto di DARS-AS1 sull'apoptosi.Come previsto, il knockdown DARS-AS1 ha aumentato significativamente la scissione PARP nelle cellule SW620 e ha aumentato la proporzione di cellule V positive all'annessina nelle linee cellulari SW620, HCT116, HepG2 e MBA-MD-231 (Fig. 3k).3).3f-h), indicando che l'effetto anti-apoptotico di DARS-AS1 nelle cellule tumorali è opposto alla funzione di induzione dell'apoptosi di PACT.Presi insieme, questi risultati suggeriscono che il meccanismo della funzione oncogenica DARS-AS1 può essere attraverso l'inibizione della funzione PACT.
Successivamente, abbiamo esplorato le implicazioni funzionali dell'associazione DARS-AS1-PACT.È stato riportato che PACT attiva PKR attraverso l'interazione diretta, che successivamente migliora la fosforilazione di eIF2α, causando delezione traslazionale e apoptosi17.Innanzitutto, abbiamo esaminato se DARS-AS1 influisce sulla localizzazione cellulare di PACT e PKR.La microscopia confocale a fluorescenza ha mostrato che PACT e PKR erano altamente colocalizzati nelle cellule SW620 con un coefficiente di correlazione di Pearson medio di 0,72.Nel frattempo, la sovraespressione DARS-AS1 ha ridotto significativamente la co-localizzazione di PACT e PKR (coefficiente di correlazione medio di Pearson 0,61) (Figura 4a).Per studiare se DARS-AS1 potrebbe modulare l'interazione PACT-PKR, abbiamo eseguito un test di co-immunoprecipitazione (co-IP) con anticorpi anti-PACT nei lisati cellulari SW620.PKR è stato altamente arricchito in anti-PACT nelle cellule di controllo, mentre il recupero di PKR è stato significativamente ridotto nei lisati di cellule che sovraesprimono DARS-AS1 (Fig. 4b).PACT e PKR marcati purificati sono stati utilizzati per saggi di legame proteico in vitro.Di conseguenza, quelli che hanno fornito DARS-AS1 ma nessun RNA di controllo hanno mostrato un'interazione PACT-PKR soppressa (Figura 4c).Tutti i risultati hanno mostrato che DARS-AS1 ha interrotto la comunicazione PACT e PKR.
è stata osservata una co-localizzazione di PACT e PKR in cellule di controllo o cellule che sovraesprimono DARS-AS1 utilizzando la microscopia a fluorescenza confocale.I nuclei sono stati colorati con DAPI.I risultati statistici sono stati ottenuti da 16 fotografie.b Co-immunoprecipitazione (co-IP) utilizzando anticorpi anti-PACT in lisati cellulari di cellule di controllo SW620 o cellule che sovraesprimono DARS-AS1.c PACT marcato, PKR purificato e trascritto in vitro con DARS-AS1 o RNA simulato sono stati incubati per l'analisi del legame proteico in vitro.Per l'immunoprecipitazione sono stati utilizzati anticorpi anti-flag.d Le immunoblot con gli anticorpi indicati sono state eseguite in cellule SW620 e HCT116 trasfettate con shRNA di controllo o DARS-AS1-shRNA seguite da fame di siero.e I livelli di espressione di DARS-AS1 hanno alterato la sensibilità cellulare al thapsigargin.Le cellule SW620 sono state trasfettate con shRNA DARS-AS1, plasmide di sovraespressione DARS-AS1 o plasmide di controllo.Le cellule sono state trattate con thapsigargin per 48 ore e la vitalità cellulare è stata determinata utilizzando il reagente MTS.f DARS-AS1 trascritto in vitro o RNA fittizio e PACT purificato sono stati utilizzati per il test di attivazione in vitro e il rilevamento di immunoblot.g Le immunoblot che utilizzano questi anticorpi sono state eseguite su cellule SW620-ctrl (a sinistra) o su cellule che sovraesprimono mutanti PKR (a destra).Queste cellule sono state quindi trasfettate con shRNA di controllo o DARS-AS1-shRNA seguite da fame di siero.h La citometria a flusso ha mostrato che l'inattivazione del mutante PKR compensava l'apoptosi indotta da DARS-AS1 nelle cellule SW620.i Immunoblot con gli anticorpi indicati sono stati eseguiti in cellule SW620 (sinistra) o HCT116 (destra).Le cellule trasfettate con shRNA di controllo o shRNA DARS-AS1 sono private di siero e integrate con inibitore PKR C16 100 nM o DMSO.Barra della scala = 5 µm.I dati mostrati sono la media ± deviazione standard di tre esperimenti.* p ≤ 0,05 t-test di Student a due code.
Si ritiene generalmente che una volta che PACT interagisce con PKR17, la fosforilazione di PKR a Thr451 possa essere indotta.I nostri risultati hanno indicato che il livello di fosforilazione di PKR era significativamente elevato nelle cellule knockdown DARS-AS1 dopo la fame di siero (Fig. 4d e Fig. 4a supplementare).Di conseguenza, abbiamo scoperto che anche la fosforilazione di eIF2α, il principale substrato PKR, era significativamente aumentata dallo shRNA DARS-AS1 (Fig. 4d e Fig. 4a supplementare).Thapsigargin è un fattore di stress del pronto soccorso che fa sì che il pronto soccorso rilasci Ca2+.È stato riportato che il trattamento con thapsigargin induce l'espressione e l'attivazione di PACT, che interagisce ulteriormente con e attiva PKR, portando all'apoptosi aumentando la fosforilazione di eIF2α 18,61.Qui, abbiamo usato thapsigargin come stimolatore del percorso PACT/PKR per indagare se DARS-AS1 può aiutare le cellule a superare lo stress inibendo il percorso PACT/PKR.Abbiamo osservato che il livello di espressione di DARS-AS1 era correlato positivamente con la resistenza cellulare al thapsigargin.Le cellule SW620 che sovraesprimono DARS-AS1 sono sopravvissute meglio se trattate con thapsigargin, mentre le cellule con knockdown DARS-AS1 sono diventate più sensibili (Fig. 4e).Coerentemente con questi risultati, la sovraespressione DARS-AS1 ha ridotto la fosforilazione PKR indotta da thapsigargin (Figura 4b supplementare).Al contrario, dopo il trattamento con thapsigargin, PKR ed eIF2α sono stati fosforilati in misura maggiore nelle cellule knockdown DARS-AS1 rispetto alle cellule di controllo (Figura 4b supplementare).È interessante notare che thapsigargin ha indotto l'espressione DARS-AS1 in modo dose-dipendente, che può indicare una funzione anti-stress di DARS-AS1 (Figura 4c supplementare).Inoltre, abbiamo eseguito test di attivazione in vitro per confermare queste osservazioni.In breve, PKR è stato purificato da lisati cellulari utilizzando un anticorpo anti-PKR, quindi incubato con PACT ricombinante e DARS-AS1 trascritto in vitro.Dopo la reazione enzimatica, il fosfo-PKR è stato rilevato utilizzando WB.I nostri risultati hanno indicato che la fosforilazione di PKR era significativamente inibita da DARS-AS1, ma non dall'RNA di controllo (Figura 4f).Questi risultati in vitro e in vivo suggeriscono che DARS-AS1 inibisce l'attivazione PKR mediata da PACT.Allo stesso tempo, abbiamo anche osservato una diminuzione del recupero PACT in presenza di DARS-AS1 (Figura 4f).Questo risultato è coerente con i risultati del test di legame proteico in vitro (Figura 4c) e illustra nuovamente la funzione di blocco di DARS-AS1 per l'associazione PACT-PKR.
Ser246 e Ser287 nel dominio D3 di PACT sono necessari per l'attivazione di PKR sotto stress cellulare.La sostituzione di due residui di serina per l'alanina ha dato il mutante PACT (mutD), che ha attivato PKR in assenza di stress, e la sostituzione dell'alanina (mutA) ha invertito il protocollo.Poiché abbiamo dimostrato l'importanza di questo dominio in associazione diretta con DARS-AS1, abbiamo generato questi due mutanti PACT per verificare se questi residui potrebbero anche essere coinvolti nell'interazione con DARS-AS1.È interessante notare che entrambi i mutanti hanno perso la capacità di legarsi a DARS-AS1 (Figura 4d supplementare), suggerendo che la struttura completa della proteina PACT potrebbe essere necessaria per un'interazione efficiente con DARS-AS1.
Inoltre, i nostri risultati suggeriscono anche che l'inibizione della proliferazione cellulare indotta da DARS-AS1-shRNA può essere parzialmente ripristinata sovraesprimendo un mutante PACT negativo dominante (PACTmutA) o un mutante PKR negativo dominante (PKRmut) (Figura complementare 4e. e).La sovraespressione dei mutanti PKR dominanti negativi ha ridotto la fosforilazione di PKR indotta dal knockdown DARS-AS1 e la fosforilazione di eIF2α nelle cellule prive di siero (Fig. 4g).Ancora più importante, la proporzione di cellule apoptotiche indotte dal knockdown DARS-AS1 è stata ridotta anche nelle cellule che sovraesprimono PKRmut (Fig. 4h e Fig. 4g supplementare).L'inibizione dell'attività della chinasi PKR compromette anche la funzione DARS-AS1, poiché i risultati hanno mostrato che il knockdown DARS-AS1 raramente ha innescato la fosforilazione di PKR e eIF2α quando le cellule sono state trattate con un inibitore C16 specifico di PKR (Fig. 4i e Fig. 4h supplementare).).Presi insieme, i nostri risultati suggeriscono che DARS-AS1 promuove la proliferazione cellulare, almeno in parte, inibendo l'attivazione PKR mediata da PACT.
Per esplorare ulteriormente il ruolo di DARS-AS1 nella tumorigenesi, abbiamo eseguito esperimenti in vivo utilizzando un modello di xenotrapianto di topo. I risultati mostrano che il knockdown di DARS-AS1 ha ridotto drasticamente la crescita del tumore nei topi (valore p <0, 0001) (Fig. 5a). I risultati mostrano che il knockdown di DARS-AS1 ha ridotto drasticamente la crescita del tumore nei topi (valore p <0, 0001) (Fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5). I risultati mostrano che il knockdown DARS-AS1 riduce drasticamente la crescita del tumore nei topi (valore p <0,0001) (Figura 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис.). I risultati hanno mostrato che il knockdown DARS-AS1 ha ridotto significativamente la crescita del tumore nei topi (valore p <0,0001) (Figura 5a).Pertanto, nel gruppo knockdown DARS-AS1, si è verificata una significativa diminuzione del volume medio del tumore di circa il 72,9% e della massa tumorale media di circa l'87,8% (Figura 5b-d).Questi risultati suggeriscono fortemente che DARS-AS1 può promuovere significativamente la crescita del tumore in vivo.
Effetti del knockdown dell'annuncio DARS-AS1 sull'oncogenesi colorettale nei topi nudi.Vengono mostrate le curve di crescita (a), la dimensione del tumore (b), il peso (c) e le immagini del tumore (d).Le barre di errore rappresentano ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, dal test t di Student a due code. n = 10. ****p < 0,0001, dal test t di Student a due code. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 t-test di Student a due code.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 t-test di Student a due code.e Kaplan-Meier ha analizzato la correlazione tra i livelli di espressione di DARS-AS1 e la sopravvivenza globale in pazienti con UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM e LGG.Alti livelli di espressione di DARS-AS1 nei pazienti erano nel 50% più ricco;il basso livello di espressione di DARS-AS1 nei pazienti era nel 50% inferiore.i valori p sono stati determinati utilizzando il log rank test.f Modello proposto in cui DARS-AS1 regola la via PACT-PKR e la crescita del tumore.
Per comprendere meglio l'impatto clinico di DARS-AS1, abbiamo esaminato la correlazione tra la sua espressione e la sopravvivenza del paziente.Analizzando il set di dati TCGA, abbiamo scoperto che una maggiore espressione di DARS-AS1 era associata a melanoma uveale (UVM), cromofobia renale (KICH), carcinoma a cellule papillari renali (KIRP), mesotelioma (MESO), multiplex.Una sopravvivenza inferiore era significativamente associata alla morfosi del glioblastoma (GBM) e ai pazienti con glioma cerebrale di basso grado (LGG) (Figura 5e).Questi risultati suggeriscono che DARS-AS1 può svolgere un ruolo importante nella progressione clinica del tumore e può essere un potenziale biomarcatore predittivo in più tumori.
In questo studio, utilizzando lo screening funzionale CRISRi su larga scala, abbiamo determinato che DARS-AS1 lncRNA supera lo stress delle cellule tumorali regolando due risposte chiave allo stress, PACT e PKR.Interagendo direttamente con PACT, DARS-AS1 ha inibito l'attivazione PKR mediata da PACT, prevenendo così la morte cellulare apoptotica e promuovendo la proliferazione cellulare (Fig. 5f).La sovraregolazione di DARS-AS1 è stata osservata in più tipi di cancro, suggerendo che la sua funzione di promuovere la sopravvivenza delle cellule tumorali in condizioni di stress può essere ampiamente applicabile a più tipi di cancro.
La PACT è stata identificata come una proteina attivatrice della PKR e l'attivazione della PKR mediata da PACT svolge un ruolo importante nelle risposte allo stress regolando la trascrizione, la traduzione, l'apoptosi e altri importanti processi cellulari62.Per decenni, sono stati fatti tentativi per comprendere la regolazione specifica del cancro della cascata PACT-PKR.Qui, il nostro studio ha rivelato un diverso meccanismo di regolazione di PACT-PKR nelle cellule tumorali attraverso lncRNA DARS-AS1 cellulare, che si lega direttamente a PACT, blocca l'interazione PACT-PKR, inibisce l'attivazione di PKR e la fosforilazione di eIF2α, inibendo così l'apoptosi indotta da stress e stimolare l'eventuale proliferazione del cancro.cellule.Questa scoperta fa luce sui potenziali bersagli lncRNA per la prognosi e la terapia del cancro.
I nostri dati hanno mostrato che il knockdown DARS-AS1 sensibilizza le cellule alla fame di siero con un aumento significativo di PKR fosforilato ed eIF2α.Questi risultati suggeriscono che DARS-AS1 promuove la sopravvivenza delle cellule tumorali in condizioni difficili inibendo l'attività PACT/PKR.Anche molti altri RNA non codificanti, come ASPACT e nc886, sono coinvolti nell'asse PACT/PKR sottoregolando l'mRNA di PACT48 o regolando l'autofosforilazione legandosi a PKR49,50,64.Tra questi, DARS-AS1 agisce come un disgregatore dell'associazione PACT-PKR.Questo studio arricchisce la nostra comprensione della regolazione dell'asse PACT/PKR e del ruolo degli lncRNA nelle risposte allo stress.
PACT contiene tre domini separati.Ciascuno dei primi due dsRBD è sufficiente per ottenere un legame ad alta affinità di PACT con PKR, mentre il terzo dominio (D3) è necessario per l'attivazione di PKR in vitro e in vivo.Il nostro studio ha mostrato che DARS-AS1 interagisce preferenzialmente con il dominio D3 (Fig. 3h).Date le grandi dimensioni dell'lncRNA (768 nucleotidi), il legame DARS-AS1 a D3 può inibire fisicamente l'interazione tra il dominio PACT di dsRBD e PKR, bloccando così l'associazione di PACT e PKR.Le mutazioni puntiformi PACT che hanno sostituito Ser246 e Ser287 in D3 con alanina o aspartato hanno interrotto la sua affinità di legame per DARS-AS1, indicando l'importanza delle proprietà strutturali ed elettriche complessive di D3 nella loro associazione.Ulteriori dettagli di questo meccanismo saranno richiesti in futuro, utilizzando analisi biochimiche più precise e analisi strutturali PACT ad alta risoluzione.
Precedenti studi hanno riportato che DARS-AS1 promuove la proliferazione cellulare attraverso diversi meccanismi51,52,53.In un esempio, i ricercatori hanno osservato che DARS-AS1 sovraregolava il suo gene DARS codificante per le proteine ​​antisenso prendendo di mira il miP-194-5p nelle cellule tumorali del rene.Tuttavia, nel presente studio, il knockdown DARS-AS1 ha avuto scarso effetto sulla trascrizione DARS in più tipi di cancro, inclusi almeno i tumori del colon-retto, della mammella e del fegato.Poiché gli lncRNA esibiscono modelli di espressione specifici delle cellule e dei tessuti, i meccanismi funzionali potrebbero non essere conservati in tutti i tipi di cancro, il che potrebbe contribuire a questa discrepanza tra le nostre osservazioni e le precedenti valutazioni di diversi tipi di cancro.Sono necessari studi speciali per chiarire i meccanismi specifici di vari processi fisiologici e patologici.
Un'analisi dei dati clinici ha mostrato che l'espressione di DARS-AS1 nei tumori è inversamente correlata alla sopravvivenza dei pazienti oncologici, il che sottolinea l'importanza dell'asse DARS-AS1/PACT/PKR nella prognosi del cancro.In conclusione, il nostro studio mostra che DARS-AS1 è un regolatore dell'asse di segnalazione PACT/PKR, promuove la proliferazione delle cellule tumorali e inibisce l'apoptosi durante la risposta allo stress, che fornisce un'altra linea di ricerca ed è di interesse per la ricerca futura su potenziali trattamenti .
Le linee cellulari umane SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 e HEK293T sono state ottenute dalla National Cell Line Resource Infrastructure in Cina.Tutte le cellule sono state mantenute in mezzo DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) integrato con il 10% di FBS (Gemini, Brooklyn, NY) e l'1% di penicillina-streptomicina (Thermo Fisher Scientific) a 37°C, 5% di CO2.incubatrice.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-bandiera, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764)) ;anti-eIF2α (fosforo S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosforo S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulina, CST (2128);IgG di topo normale, CST (5415S);normale coniglio IgG, CST (2729S).Gli anticorpi sono stati diluiti 1:1000 in PBST per Western blotting e 1:100 per IP.
Gli sgRNA sono stati sviluppati utilizzando uno strumento disponibile pubblicamente chiamato CRISPR-ERA66.Abbiamo utilizzato i parametri dello strumento predefinito per lo sviluppo di sgRNA e l'algoritmo ha calcolato i siti di legame dello sgRNA nella regione di 3 kb.centrato presso TSS.Pool di oligonucleotidi di sgRNA sono stati sintetizzati presso CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) e clonati in plasmidi pgRNA umanizzati (Addgene n. 44248).Un totale di 12 µg di plasmide pgRNA umanizzato in pool, 7,2 µg di psPAX2 (Addgene n. 12260) e 4,8 µg di pMD2.G (Addgene n. 12259) sono stati co-trasfettati in 5 x 106 HEK293T in piastre da 10 cm usando il reagente di trasfezione DNAfect cellule ( CWBIO, Pechino, Cina) seguendo le istruzioni del produttore.I supernatanti contenenti virus sono stati raccolti 48 e 72 ore dopo la trasfezione e filtrati attraverso un filtro da 0,45 µm.Per lo screening, le cellule SW620 che esprimono la proteina di fusione dCas9/KRAB sono state ottenute mediante trasduzione del virus.Le cellule SW620 modificate sono state infettate con la libreria di virus in quattro esperimenti di infezione indipendenti a un MOI di 0,1-0,3 e sono state campionate con 2 μg/ml di puromicina (Sigma, St. Louis, MO) per 2 giorni.Successivamente, le cellule sono state coltivate per 18 giorni in vitro con una copertura minima della libreria di 500 cellule/sgRNA per lo screening.
Il DNA genomico è stato estratto secondo le istruzioni del kit QIAamp DNA Blood Midi (QIAGEN, Düsseldorf, Germania; 51183).In totale, per costruire la libreria sono stati utilizzati 100 μg di DNA genomico per ripetizione biologica.La regione sgRNA è stata amplificata da due cicli di PCR e collegata a un codice a barre.
I prodotti PCR sono stati purificati utilizzando il gel NucleoSpin® e il kit di purificazione PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germania; 740609.250) e quantificati utilizzando il kit di rilevamento del DNA a doppio filamento Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Il test MTS è stato utilizzato per misurare la proliferazione cellulare.Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti ad una densità iniziale di 2000 cellule/pozzetto.Il numero relativo di cellule è stato misurato giornalmente all'ora indicata per un totale di 4-6 giorni.Per ogni pozzetto, 20 μl di reagente MTS (Promega) sono stati diluiti con 100 μl di DMEM, incubati con cellule per 4 ore a 37 ° C, quindi è stato misurato OD490.
La capacità di crescita disancorata è stata scoperta analizzando la formazione delle sfere.In breve, 2000 cellule trasfettate con shRNA DARS-AS1 o shRNA di controllo sono state coltivate in micropiastre ad attacco ultra basso (Corning) con variazione media ogni 4 giorni.Gli sferoidi sono stati contati dopo 14 giorni.500 cellule trasfettate con il plasmide di sovraespressione DARS-AS1 o un plasmide di controllo sono state utilizzate per il test di potenziamento, altrimenti il ​​metodo è rimasto invariato.
L'RNA è stato trascritto utilizzando T7 RNA polimerasi e biotina-16-UTP (Roche 1138908910) secondo le istruzioni di Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).I primer utilizzati qui sono elencati nella tabella supplementare 4.
Le regioni PACT o PKR codificanti proteine ​​sono state clonate in pET15b (Addgene #73619) e trasformate in BL21(DE3).I batteri sono stati incubati per una notte in LB fornito di ampicillina e quindi diluiti 100 volte con LB fresco.Quando la OD600 del mezzo ha raggiunto 0,8, è stato aggiunto 1 mM IPTG per indurre l'espressione proteica.Dopo incubazione per una notte con agitazione delicata (250 rpm a 20°C), il pellet cellulare è stato raccolto mediante centrifugazione (4000 rpm, 10 min, 4°C).Risospendere il pellet cellulare nel tampone di lisi (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) e incubare in ghiaccio per 30 min, quindi sonicare (15 min, 5 s on/off, su ghiaccio) e centrifugare (13.000 giri/min)., 30 min, 4°С).Il supernatante è stato quindi caricato su resina Ni-NTA (QIAGEN) 3 volte a 4°C, lavato 4 volte con tampone di lavaggio (Tris 50 mM, pH 8,0, imidazolo 40 mM, NaCl 250 mM) ed eluito 3 volte, con un totale di 10 ml di tampone eluente (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 250 mM, imidazolo 300 mM).La proteina purificata è stata determinata utilizzando il WB e la concentrazione è stata determinata utilizzando il kit di analisi delle proteine ​​Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
I saggi RIP sono stati eseguiti come descritto in precedenza, con modifiche.In breve, 1 tampone RIP (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, 0,5% NP-40, inibitore della ribonucleasi RNasin (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteasi) lisi citostatica 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) e centrifugare a 13.000 rpm per 15 min a 4 gradi centigradi.Il supernatante è stato quindi incubato con perline magnetiche di proteina A+G (Millipore) coniugate con 5 μg di anticorpo anti-PACT (Abeam) o IgG (CST).Le perline sono state lavate 5 volte con tampone RIP 5x, quindi digerite con proteinasi K (NEB).L'RNA è stato estratto con Trizol e determinato mediante RT-qPCR.I primer sono presentati nella tabella supplementare 5.
Il test RIP in vitro è stato eseguito secondo un protocollo di test RIP standard modificato.Un totale di 5 pmol di RNA trascritto in vitro è stato diluito 1x con tampone RIP e ricotto mediante incubazione a 65°C per 5 minuti seguito da lento raffreddamento a temperatura ambiente.Un totale di 5 pmol di proteine ​​PACT contrassegnate con flag intatte o mutate sono state purificate da E. coli.Incubare con RNA rinaturato per 2 ore a 4°C e seguire la procedura sopra per l'analisi RIP per IP anti-flag.
Per l'analisi dell'estensione dell'RNA, 1 × 107 cellule sono state lisate con tampone 1xRIP.Dopo centrifugazione a 13.000 rpm per 15 minuti a 4°C, il supernatante è stato pretrattato con 30 μl di microsfere magnetiche di streptavidina (Beckman) per 2 ore a 4°C.Il lisato purificato è stato quindi fornito con tRNA di lievito e incubato con 40 pmol di RNA rinaturato per una notte a 4°C, quindi per altre 2 ore e sono stati aggiunti 20 μl di nuove sfere magnetiche di streptavidina bloccate con BSA.La fase di lavaggio consisteva in 4 volte con 5x tampone RIP e 4 volte con 1x tampone RIP.Le proteine ​​corrispondenti sono state eluite con tampone di eluizione della biotina (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotina, PMSF) e separate su NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Dopo la colorazione con argento (Beyotime Biotechnology), alcune bande sono state asportate e analizzate mediante MS.
L'analisi Co-IP è stata eseguita per testare l'interazione tra PACT e PKR.In breve, i lisati surnatanti sono stati preparati incubando 1 x 107 cellule lisate in 1 x tampone RIP seguito da centrifugazione a 13.000 rpm per 15 minuti a 4°C.I lisati sono stati caricati con sfere magnetiche di proteina A + G, coniugati con 5 µg di anticorpo anti-PACT e ruotati delicatamente durante la notte a 4°C.Le perline sono state lavate 3 volte con 5 × tampone RIP, due volte con 1 × tampone RIP ed eluite con 1 × tampone SDS.La proteina recuperata è stata analizzata dal gel SDS-PAGE e rilevata da WB.
Due pmol di PACT contrassegnato e 1 pmol di PKR sono state purificate da E. coli.Diluire in 1 × tampone RIP e incubare con 10 pmol di RNA rinaturato per 2 ore a 4 gradi centigradi.Successivamente, sono stati incubati con un anticorpo anti-marcato coniugato con microsfere magnetiche della proteina A+G per altre due ore.Le perline sono state quindi lavate quattro volte con 1x tampone RIP ed eluite con 1x tampone SDS.Il PACT e PKR risultanti sono stati rilevati da WB.