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Fotosensibilizzanti efficaci sono particolarmente importanti per l'uso clinico diffuso della fototerapia.Tuttavia, i fotosensibilizzatori convenzionali generalmente soffrono di assorbimento di lunghezza d'onda corta, fotostabilità insufficiente, bassa resa quantica di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e spegnimento di ROS indotto dall'aggregazione.Qui riportiamo un fotosensibilizzante supramolecolare (RuDA) nel vicino infrarosso (NIR) mediato dall'autoassemblaggio di complessi organometallici Ru(II)-arene in soluzione acquosa.RuDA può generare solo ossigeno singoletto (1O2) nello stato aggregato e mostra un evidente comportamento di generazione di 1O2 indotto dall'aggregazione a causa di un aumento significativo del processo di crossover tra il sistema singoletto-tripletto.Sotto l'azione della luce laser a 808 nm, RuDA mostra una resa quantica di 1O2 del 16,4% (verde indocianina approvato dalla FDA: ΦΔ=0,2%) e un'elevata efficienza di conversione fototermica del 24,2% (nanobarre d'oro commerciali) con un'eccellente fotostabilità.: 21,0%, nanoshell d'oro: 13,0%.Inoltre, le RuDA-NP con una buona biocompatibilità possono accumularsi preferenzialmente nei siti del tumore, causando una significativa regressione del tumore durante la terapia fotodinamica con una riduzione del 95,2% del volume del tumore in vivo.Questa terapia fotodinamica che migliora l'aggregazione fornisce una strategia per lo sviluppo di fotosensibilizzanti con proprietà fotofisiche e fotochimiche favorevoli.
Rispetto alla terapia convenzionale, la terapia fotodinamica (PDT) è un trattamento interessante per il cancro grazie ai suoi vantaggi significativi come il controllo spazio-temporale accurato, la non invasività, la resistenza ai farmaci trascurabile e la riduzione al minimo degli effetti collaterali 1,2,3.Sotto l'irradiazione della luce, i fotosensibilizzanti utilizzati possono essere attivati ​​per formare specie altamente reattive dell'ossigeno (ROS), portando a apoptosi/necrosi o risposte immunitarie4,5. Tuttavia, la maggior parte dei fotosensibilizzanti convenzionali, come cloro, porfirine e antrachinoni, hanno un assorbimento di lunghezza d'onda relativamente corta (frequenza < 680 nm), con conseguente scarsa penetrazione della luce a causa dell'intenso assorbimento di molecole biologiche (ad es. emoglobina e melanina) in la regione visibile6,7. Tuttavia, la maggior parte dei fotosensibilizzanti convenzionali, come cloro, porfirine e antrachinoni, hanno un assorbimento di lunghezza d'onda relativamente corta (frequenza < 680 nm), con conseguente scarsa penetrazione della luce a causa dell'intenso assorbimento di molecole biologiche (ad es. emoglobina e melanina) in la regione visibile6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. Tuttavia, i fotosensibilizzanti più comuni come cloro, porfirine e antrachinoni hanno un assorbimento di lunghezza d'onda relativamente breve (< 680 nm) con conseguente scarsa penetrazione della luce a causa dell'intenso assorbimento di molecole biologiche (ad es. emoglobina e melanina) nella regione del visibile6,7.然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 如 二 氢 卟酚 、 卟啉 和 蒽醌 ， 具有 相对 较 短 的 的 吸收 （频率 <680 nm） ， 因此 由于 对 生物 分子 （（如 血红 蛋白 和 黑色素） 的 强烈 吸收 吸收 吸收 吸收导致光穿透性差。然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 ， ， 具有 较 较 短 的 波长 吸收 （频率 频率 <680 nm） 因此 由于 分子 （血红 血红 蛋白 和 黑色素） 的 ， ， ， ， 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 ， ， ， ， ， ， ， 吸收 吸收 吸收 吸收吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. Tuttavia, la maggior parte dei fotosensibilizzanti tradizionali come cloro, porfirine e antrachinoni hanno un assorbimento di lunghezza d'onda relativamente breve (frequenza < 680 nm) a causa del forte assorbimento di biomolecole come l'emoglobina e la melanina con conseguente scarsa penetrazione della luce.Area visibile 6.7.Pertanto, i fotosensibilizzatori che assorbono il vicino infrarosso (NIR) attivati ​​nella "finestra terapeutica" di 700-900 nm sono adatti per la fototerapia.Poiché la luce del vicino infrarosso è la meno assorbita dai tessuti biologici, può portare a una penetrazione più profonda e a un minor fotodanneggiamento8,9.
Sfortunatamente, i fotosensibilizzatori esistenti che assorbono i NIR hanno generalmente una scarsa fotostabilità, una bassa capacità di generazione di ossigeno singoletto (1O2) e un quenching 1O2 indotto dall'aggregazione, che ne limita l'applicazione clinica10,11.Sebbene siano stati compiuti grandi sforzi per migliorare le proprietà fotofisiche e fotochimiche dei fotosensibilizzatori convenzionali, finora diversi rapporti hanno riportato che i fotosensibilizzatori che assorbono i NIR possono risolvere tutti questi problemi.Inoltre, diversi fotosensibilizzatori hanno mostrato risultati promettenti per una generazione efficiente di 1O212,13,14 quando irradiato con luce superiore a 800 nm, poiché l'energia del fotone diminuisce rapidamente nella regione del vicino IR.Trifenilammina (TFA) come donatore di elettroni e [1,2,5]tiadiazolo-[3,4-i]dipirido[a,c]fenazina (TDP) come gruppo accettore di elettroni Il tipo di donatore-accettore (DA) colora una classe di coloranti, assorbenti il ​​vicino infrarosso, che sono stati ampiamente studiati per la bioimaging II del vicino infrarosso e la terapia fototermica (PTT) a causa del loro stretto gap di banda.Pertanto, i coloranti di tipo DA possono essere utilizzati per la PDT con eccitazione nel vicino IR, sebbene siano stati raramente studiati come fotosensibilizzanti per la PDT.
È noto che l'elevata efficienza dell'intersystem crossing (ISC) dei fotosensibilizzanti favorisce la formazione di 1O2.Una strategia comune per far avanzare il processo ISC consiste nel migliorare l'accoppiamento spin-orbita (SOC) dei fotosensibilizzanti introducendo atomi pesanti o frazioni organiche speciali.Tuttavia, questo approccio presenta ancora alcuni svantaggi e limitazioni19,20.Recentemente, l'autoassemblaggio supramolecolare ha fornito un approccio intelligente dal basso verso l'alto per la fabbricazione di materiali funzionali a livello molecolare,21,22 con numerosi vantaggi nella fototerapia: (1) i fotosensibilizzatori autoassemblati possono avere il potenziale per formare strutture a nastro.Simile alle strutture elettroniche con una distribuzione più densa dei livelli di energia a causa delle orbite sovrapposte tra i blocchi costitutivi.Pertanto, la corrispondenza energetica tra lo stato eccitato di singoletto inferiore (S1) e lo stato eccitato di tripletta vicina (Tn) sarà migliorata, il che è vantaggioso per il processo ISC 23, 24.(2) L'assemblaggio supramolecolare ridurrà il rilassamento non radiativo basato sul meccanismo di limitazione del movimento intramolecolare (RIM), che promuove anche il processo ISC 25, 26.(3) L'assieme supramolecolare può proteggere le molecole interne del monomero dall'ossidazione e dalla degradazione, migliorando così notevolmente la fotostabilità del fotosensibilizzante.Dati i vantaggi di cui sopra, riteniamo che i sistemi fotosensibilizzatori supramolecolari possano essere un'alternativa promettente per superare le carenze della PDT.
I complessi a base di Ru(II) sono una piattaforma medica promettente per potenziali applicazioni nella diagnosi e nella terapia delle malattie grazie alle loro proprietà biologiche uniche e attraenti28,29,30,31,32,33,34.Inoltre, l'abbondanza di stati eccitati e le proprietà fotofisiochimiche sintonizzabili dei complessi a base di Ru(II) forniscono grandi vantaggi per lo sviluppo di fotosensibilizzanti a base di Ru(II)35,36,37,38,39,40.Un esempio degno di nota è il complesso polipiridilico di rutenio(II) TLD-1433, che è attualmente in studi clinici di Fase II come fotosensibilizzante per il trattamento del cancro della vescica non muscolare invasivo (NMIBC)41.Inoltre, i complessi organometallici di rutenio(II)arene sono ampiamente utilizzati come agenti chemioterapici per il trattamento del cancro a causa della loro bassa tossicità e facilità di modifica42,43,44,45.Le proprietà ioniche dei complessi organometallici Ru(II)-arene possono non solo migliorare la scarsa solubilità dei cromofori DA nei comuni solventi, ma anche migliorare l'assemblaggio dei cromofori DA.Inoltre, la struttura semi-sandwich pseudoottaedrica dei complessi organometallici di Ru(II) -areni può impedire stericamente l'aggregazione H dei cromofori di tipo DA, facilitando così la formazione di aggregazione J con bande di assorbimento spostate verso il rosso.Tuttavia, gli svantaggi intrinseci dei complessi Ru(II)-arene, come la bassa stabilità e/o la scarsa biodisponibilità, possono influenzare l'efficacia terapeutica e l'attività in vivo dei complessi arene-Ru(II).Tuttavia, gli studi hanno dimostrato che questi svantaggi possono essere superati incapsulando complessi di rutenio con polimeri biocompatibili mediante incapsulamento fisico o coniugazione covalente.
In questo lavoro, riportiamo complessi DA-coniugati di Ru(II)-arene (RuDA) con un trigger NIR tramite un legame di coordinazione tra il cromoforo DAD e la parte Ru(II)-arene.I complessi risultanti possono autoassemblarsi in vescicole metallosuramolecolari in acqua a causa di interazioni non covalenti.In particolare, l'assieme supramolecolare ha dotato RuDA di proprietà di attraversamento intersistemico indotte dalla polimerizzazione, che hanno aumentato significativamente l'efficienza ISC, il che era molto favorevole per PDT (Fig. 1A).Per aumentare l'accumulo di tumore e la biocompatibilità in vivo, Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) approvato dalla FDA è stato utilizzato per incapsulare RuDA47,48,49 per creare nanoparticelle RuDA-NP (Figura 1B) che fungevano da PDT/Dual-efficiente modalità proxy PTT.Nella fototerapia del cancro (Figura 1C), RuDA-NP è stato utilizzato per trattare topi nudi con tumori MDA-MB-231 per studiare l'efficacia di PDT e PTT in vivo.
Illustrazione schematica del meccanismo fotofisico di RuDA in forme monomeriche e aggregate per la fototerapia del cancro, sintesi di B RuDA-NP e C RuDA-NP per PDT e PTT attivate da NIR.
RuDA, costituito da funzionalità TPA e TDP, è stato preparato secondo la procedura mostrata nella Figura 1 supplementare (Figura 2A) e RuDA è stato caratterizzato da spettri NMR 1H e 13C, spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray e analisi elementare (Figure supplementari 2-4 ).La mappa della differenza di densità elettronica RuDA della transizione di singoletto più bassa è stata calcolata dalla teoria del funzionale della densità dipendente dal tempo (TD-DFT) per studiare il processo di trasferimento di carica.Come mostrato nella Figura 5 supplementare, la densità elettronica si sposta principalmente dalla trifenilammina all'unità accettore TDP dopo la fotoeccitazione, che può essere attribuita a una tipica transizione di trasferimento di carica intramolecolare (CT).
Struttura chimica di Ore. B Spettri di assorbimento di Ore in miscele di vari rapporti di DMF e acqua.C Valori di assorbimento normalizzati di RuDA (800 nm) e ICG (779 nm) rispetto al tempo a 0,5 W cm-2 di luce laser a 808 nm.D La fotodegradazione dell'ABDA è indicata dalla formazione di 1O2 indotta da RuDA in miscele DMF/H2O con diverso contenuto d'acqua sotto l'azione di radiazioni laser con lunghezza d'onda di 808 nm e potenza di 0,5 W/cm2.
Riassunto: la spettroscopia di assorbimento UV-visibile è stata utilizzata per studiare le proprietà di autoassemblaggio del minerale metallifero in miscele di DMF e acqua in vari rapporti.Come mostrato in fig.2B, RuDA mostra bande di assorbimento da 600 a 900 nm in DMF con una banda di assorbimento massima a 729 nm.L'aumento della quantità di acqua ha portato a un graduale spostamento verso il rosso del massimo di assorbimento del minerale a 800 nm, che indica l'aggregazione J del minerale nel sistema assemblato.Gli spettri di fotoluminescenza di RuDA in diversi solventi sono mostrati nella Figura 6 supplementare. RuDA sembra mostrare la tipica luminescenza NIR-II con una lunghezza d'onda di emissione massima di ca.1050 nm rispettivamente in CH2Cl2 e CH3OH.Il grande spostamento di Stokes (circa 300 nm) di RuDA indica un cambiamento significativo nella geometria dello stato eccitato e la formazione di stati eccitati a bassa energia.Le rese quantiche di luminescenza di Ore in CH2Cl2 e CH3OH sono state determinate rispettivamente del 3,3 e dello 0,6%.Tuttavia, in una miscela di metanolo e acqua (5/95, v/v), sono stati osservati un leggero spostamento verso il rosso dell'emissione e una diminuzione della resa quantica (0,22%), che potrebbe essere dovuto all'autoassemblaggio di Ore .
Per visualizzare l'autoassemblaggio di ORE, abbiamo utilizzato la microscopia a forza atomica liquida (AFM) per visualizzare i cambiamenti morfologici in ORE nella soluzione di metanolo dopo l'aggiunta di acqua.Quando il contenuto di acqua era inferiore all'80%, non è stata osservata alcuna chiara aggregazione (Figura 7 supplementare).Tuttavia, con un ulteriore aumento del contenuto d'acqua al 90-95%, sono comparse piccole nanoparticelle, che indicavano l'autoassemblaggio di Ore. Inoltre, l'irradiazione laser con una lunghezza d'onda di 808 nm non ha influenzato l'intensità di assorbimento di RuDA in ambiente acquoso soluzione (Fig. 2C e Fig. 8 supplementare).Al contrario, l'assorbanza del verde indocianina (ICG come controllo) è diminuita rapidamente a 779 nm, indicando un'eccellente fotostabilità di RuDA.Inoltre, la stabilità di RuDA-NPs in PBS (pH = 5,4, 7,4 e 9,0), 10% FBS e DMEM (alto glucosio) è stata esaminata mediante spettroscopia di assorbimento UV-visibile in vari punti temporali.Come mostrato nella Figura 9 supplementare, sono stati osservati lievi cambiamenti nelle bande di assorbimento di RuDA-NP in PBS a pH 7,4/9,0, FBS e DMEM, indicando un'eccellente stabilità di RuDA-NP.Tuttavia, in un mezzo acido (рН = 5,4) è stata trovata l'idrolisi del minerale.Abbiamo inoltre valutato ulteriormente la stabilità di RuDA e RuDA-NP utilizzando metodi di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).Come mostrato nella Figura 10 supplementare, RuDA era stabile in una miscela di metanolo e acqua (50/50, v/v) per la prima ora e l'idrolisi è stata osservata dopo 4 ore.Tuttavia, per le NP RuDA è stato osservato solo un ampio picco concavo-convesso.Pertanto, è stata utilizzata la cromatografia a permeazione di gel (GPC) per valutare la stabilità delle NP RuDA in PBS (pH = 7,4).Come mostrato nella Figura 11 supplementare, dopo 8 ore di incubazione nelle condizioni testate, l'altezza del picco, la larghezza del picco e l'area del picco di NP RuDA non sono cambiate in modo significativo, indicando un'eccellente stabilità di NP RuDA.Inoltre, le immagini TEM hanno mostrato che la morfologia delle nanoparticelle RuDA-NP è rimasta praticamente invariata dopo 24 ore nel tampone PBS diluito (pH = 7,4, Figura 12 supplementare).
Poiché l'autoassemblaggio può conferire diverse caratteristiche funzionali e chimiche al minerale, abbiamo osservato il rilascio di acido 9,10-antracenediilbis(metilene)dimalonico (ABDA, indicatore 1O2) in miscele metanolo-acqua.Minerale con diverso contenuto d'acqua50.Come mostrato nella Figura 2D e nella Figura 13 supplementare, non è stata osservata alcuna degradazione di ABDA quando il contenuto di acqua era inferiore al 20%.Con un aumento dell'umidità al 40%, si è verificata la degradazione dell'ABDA, come evidenziato da una diminuzione dell'intensità della fluorescenza dell'ABDA.È stato anche osservato che un contenuto di acqua più elevato si traduce in un degrado più rapido, suggerendo che l'autoassemblaggio di RuDA è necessario e vantaggioso per il degrado dell'ABDA.Questo fenomeno è molto diverso dai moderni cromofori ACQ (estinzione indotta dall'aggregazione).Quando irradiato con un laser con una lunghezza d'onda di 808 nm, la resa quantica di 1O2 RuDA in una miscela di 98% H2O/2% DMF è 16,4%, che è 82 volte superiore a quella di ICG (ΦΔ = 0,2%)51, dimostrando una notevole efficienza di generazione 1O2 RuDA nello stato di aggregazione.
Spin di elettroni utilizzando 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinone (TEMP) e 5,5-dimetil-1-pirrolina N-ossido (DMPO) come trappole di spin La spettroscopia di risonanza (ESR) è stata utilizzata per identificare le specie risultanti AFK.di RuDA.Come mostrato nella Figura 14 supplementare, è stato confermato che 1O2 viene generato a tempi di irradiazione compresi tra 0 e 4 minuti.Inoltre, quando RuDA è stato incubato con DMPO sotto irradiazione, è stato rilevato un tipico segnale EPR a quattro linee di addotto 1:2:2:1 DMPO-OH·, che indica la formazione di radicali idrossilici (OH·).Nel complesso, i risultati di cui sopra dimostrano la capacità di RuDA di stimolare la produzione di ROS attraverso un doppio processo di fotosensibilizzazione di tipo I/II.
Per comprendere meglio le proprietà elettroniche di RuDA in forme monomeriche e aggregate, gli orbitali molecolari di frontiera di RuDA in forme monomeriche e dimeriche sono stati calcolati utilizzando il metodo DFT.Come mostrato in fig.3A, l'orbitale molecolare più alto occupato (HOMO) di RuDA monomerico è delocalizzato lungo la spina dorsale del ligando e l'orbitale molecolare più basso non occupato (LUMO) è centrato sull'unità accettore TDP.Al contrario, la densità elettronica nel dimerico HOMO è concentrata sul ligando di una molecola di RuDA, mentre la densità elettronica nel LUMO è concentrata principalmente sull'unità accettore di un'altra molecola di RuDA, il che indica che RuDA è nel dimero.Caratteristiche di CT.
A L'HOMO e il LUMO di Ore sono calcolati in forma monomerica e dimerica.B Livelli energetici di singoletto e tripletta di minerale in monomeri e dimeri.C Livelli stimati di RuDA e possibili canali ISC come C monomerico e D dimerico. Le frecce indicano possibili canali ISC.
La distribuzione di elettroni e lacune negli stati eccitati di singoletto a bassa energia di RuDA nelle forme monomeriche e dimeriche è stata analizzata utilizzando il software Multiwfn 3.852.53, che è stato calcolato utilizzando il metodo TD-DFT.Come indicato sull'etichetta aggiuntiva.Come mostrato nelle Figure 1-2, i fori RDA monomerici sono per lo più delocalizzati lungo la spina dorsale del ligando in questi stati eccitati di singoletto, mentre gli elettroni si trovano principalmente nel gruppo TDP, a dimostrazione delle caratteristiche intramolecolari della TC.Inoltre, per questi stati eccitati di singoletto, c'è più o meno sovrapposizione tra lacune ed elettroni, suggerendo che questi stati eccitati di singoletto danno un contributo dall'eccitazione locale (LE).Per i dimeri, oltre alle caratteristiche TC e LE intramolecolari, è stata osservata una certa proporzione di caratteristiche TC intermolecolari nei rispettivi stati, in particolare S3, S4, S7 e S8, sulla base dell'analisi TC intermolecolare, con transizioni intermolecolari TC come le principali (Tabella Supplementare).3).
Per comprendere meglio i risultati sperimentali, abbiamo ulteriormente esplorato le proprietà degli stati eccitati di RuDA per esplorare le differenze tra monomeri e dimeri (Tabelle Supplementari 4-5).Come mostrato nella Figura 3B, i livelli di energia degli stati eccitati di singoletto e tripletta del dimero sono molto più densi di quelli del monomero, il che aiuta a ridurre il divario energetico tra S1 e Tn. È stato riportato che le transizioni ISC potrebbero essere realizzate all'interno di un piccolo divario energetico (ΔES1-Tn < 0,3 eV) tra S1 e Tn54. È stato riportato che le transizioni ISC potrebbero essere realizzate all'interno di un piccolo divario energetico (ΔES1-Tn < 0,3 eV) tra S1 e Tn54. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергетической щели (ΔES1-Tn <0,3 эВ) между S1 и Tn54. È stato riportato che le transizioni ISC possono essere realizzate entro un piccolo divario energetico (ΔES1-Tn <0,3 eV) tra S1 e Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0.3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0.3 eV）内实现。 Сообщалось, что переход ISC может быть реализован в пределах небольшой энергетической щели (ΔES1-Tn < 0,3 эВ) между S1 и Tn54. È stato riportato che la transizione ISC può essere realizzata all'interno di un piccolo gap energetico (ΔES1-Tn < 0,3 eV) tra S1 e Tn54.Inoltre, solo un orbitale, occupato o non occupato, deve differire negli stati di singoletto e tripletta legati per fornire un integrale SOC diverso da zero.Pertanto, sulla base dell'analisi dell'energia di eccitazione e della transizione orbitale, tutti i possibili canali della transizione ISC sono mostrati nelle Figg.3C,D.In particolare, nel monomero è disponibile un solo canale ISC, mentre la forma dimerica ha quattro canali ISC che possono migliorare la transizione ISC.Pertanto, è ragionevole presumere che più molecole di RuDA sono aggregate, più accessibili saranno i canali ISC.Pertanto, gli aggregati RuDA possono formare strutture elettroniche a due bande negli stati di singoletto e tripletta, riducendo il divario energetico tra S1 e Tn disponibile, aumentando così l'efficienza dell'ISC per facilitare la generazione di 1O2.
Per chiarire ulteriormente il meccanismo sottostante, abbiamo sintetizzato un composto di riferimento del complesso arene-Ru(II) (RuET) sostituendo due gruppi etilici con due gruppi trifenilamminici fenilici in RuDA (Fig. 4A, per la caratterizzazione completa, vedere ESI, Supplementare 15 -21) Dal donatore (dietilammina) all'accettore (TDF), RuET ha le stesse caratteristiche TC intramolecolari di RuDA.Come previsto, lo spettro di assorbimento di RuET in DMF ha mostrato una banda di trasferimento di carica a bassa energia con un forte assorbimento nella regione del vicino infrarosso nella regione di 600–1100 nm (Fig. 4B).Inoltre, è stata osservata anche l'aggregazione di RuET con l'aumento del contenuto d'acqua, che si è riflesso nello spostamento verso il rosso del massimo di assorbimento, che è stato ulteriormente confermato dall'imaging AFM liquido (Figura 22 supplementare).I risultati mostrano che RuET, come RuDA, può formare stati intramolecolari e autoassemblarsi in strutture aggregate.
Struttura chimica di RuET.B Spettri di assorbimento di RuET in miscele di vari rapporti di DMF e acqua.Trame C EIS Nyquist per RuDA e RuET.Risposte fotocorrenti D di RuDA e RuET sotto l'azione della radiazione laser con una lunghezza d'onda di 808 nm.
La fotodegradazione di ABDA in presenza di RuET è stata valutata mediante irraggiamento con un laser con lunghezza d'onda di 808 nm.Sorprendentemente, non è stata osservata alcuna degradazione dell'ABDA in varie frazioni d'acqua (Figura 23 supplementare).Una possibile ragione è che RuET non può formare in modo efficiente una struttura elettronica a bande perché la catena etilica non promuove un trasferimento di carica intermolecolare efficiente.Pertanto, sono state eseguite la spettroscopia di impedenza elettrochimica (EIS) e le misurazioni della fotocorrente transitoria per confrontare le proprietà fotoelettrochimiche di RuDA e RuET.Secondo il grafico di Nyquist (Figura 4C), RuDA mostra un raggio molto più piccolo di RuET, il che significa che RuDA56 ha un trasporto di elettroni intermolecolare più veloce e una migliore conduttività.Inoltre, la densità di fotocorrente di RuDA è molto superiore a quella di RuET (Fig. 4D), confermando la migliore efficienza di trasferimento di carica di RuDA57.Pertanto, il gruppo fenilico della trifenilammina in Ore gioca un ruolo importante nel fornire il trasferimento di carica intermolecolare e la formazione di una struttura elettronica a bande.
Per aumentare l'accumulo di tumore e la biocompatibilità in vivo, abbiamo ulteriormente incapsulato RuDA con F127.Il diametro idrodinamico medio di RuDA-NPs è stato determinato in 123,1 nm con una distribuzione stretta (PDI = 0,089) utilizzando il metodo di diffusione dinamica della luce (DLS) (Figura 5A), che ha promosso l'accumulo di tumore aumentando la permeabilità e la ritenzione.EPR) effetto.Le immagini TEM hanno mostrato che le Ore NP hanno una forma sferica uniforme con un diametro medio di 86 nm.In particolare, il massimo di assorbimento delle RuDA-NP è apparso a 800 nm (Figura 24 supplementare), indicando che le RuDA-NP possono mantenere le funzioni e le proprietà dei RuDA autoassemblanti.La resa quantica ROS calcolata per NP Ore è del 15,9%, che è paragonabile a Ore. Le proprietà fototermiche delle NP RuDA sono state studiate sotto l'azione della radiazione laser con una lunghezza d'onda di 808 nm utilizzando una telecamera a infrarossi.Come mostrato in fig.5B,C, il gruppo di controllo (solo PBS) ha subito un leggero aumento della temperatura, mentre la temperatura della soluzione di RuDA-NPs è aumentata rapidamente con l'aumento della temperatura (ΔT) a 15,5, 26,1 e 43,0°C.Le alte concentrazioni erano rispettivamente di 25, 50 e 100 µM, il che indica un forte effetto fototermico delle NP RuDA.Inoltre, sono state effettuate misurazioni del ciclo di riscaldamento/raffreddamento per valutare la stabilità fototermica di RuDA-NP e confrontarle con l'ICG.La temperatura delle NP di Ore non è diminuita dopo cinque cicli di riscaldamento/raffreddamento (Fig. 5D), il che indica l'eccellente stabilità fototermica delle NP di Ore.Al contrario, l'ICG mostra una stabilità fototermica inferiore, come si vede dall'apparente scomparsa dell'altopiano della temperatura fototermica nelle stesse condizioni.Secondo il metodo precedente58, l'efficienza di conversione fototermica (PCE) di RuDA-NP è stata calcolata come 24,2%, che è superiore ai materiali fototermici esistenti come nanorods d'oro (21,0%) e nanoshell d'oro (13,0%)59.Pertanto, NP Ore mostra eccellenti proprietà fototermiche, il che li rende promettenti agenti PTT.
Analisi delle immagini DLS e TEM delle NP RuDA (riquadro).B Immagini termiche di varie concentrazioni di NP RuDA esposte a radiazioni laser a una lunghezza d'onda di 808 nm (0,5 W cm-2).C Curve di conversione fototermica di varie concentrazioni di minerali NP, che sono dati quantitativi.B. D Aumento della temperatura di ORE NP e ICG su 5 cicli di riscaldamento-raffreddamento.
La fotocitotossicità delle NP RuDA contro le cellule di cancro al seno umano MDA-MB-231 è stata valutata in vitro.Come mostrato in fig.6A, B, RuDA-NPs e RuDA hanno mostrato una citotossicità trascurabile in assenza di irradiazione, implicando una minore tossicità oscura di RuDA-NPs e RuDA.Tuttavia, dopo l'esposizione alla radiazione laser a una lunghezza d'onda di 808 nm, le NP RuDA e RuDA hanno mostrato una forte fotocitotossicità contro le cellule tumorali MDA-MB-231 con valori IC50 (concentrazione inibitoria metà-massima) rispettivamente di 5,4 e 9,4 μM, dimostrando che RuDA-NP e RuDA hanno un potenziale per la fototerapia del cancro.Inoltre, la fotocitotossicità di RuDA-NP e RuDA è stata ulteriormente studiata in presenza di vitamina C (Vc), uno scavenger di ROS, per chiarire il ruolo dei ROS nella citotossicità indotta dalla luce.Ovviamente, la vitalità cellulare è aumentata dopo l'aggiunta di Vc e i valori IC50 di RuDA e RuDA NP erano rispettivamente di 25,7 e 40,0 μM, il che dimostra l'importante ruolo dei ROS nella fotocitotossicità di RuDA e RuDA NP.Citotossicità indotta dalla luce di RuDA-NPs e RuDA nelle cellule tumorali MDA-MB-231 mediante colorazione di cellule vive/morte utilizzando calceina AM (fluorescenza verde per cellule vive) e ioduro di propidio (PI, fluorescenza rossa per cellule morte).confermato dalle cellule) come sonde fluorescenti.Come mostrato nella Figura 6C, le cellule trattate con RuDA-NP o RuDA sono rimaste vitali senza irradiazione, come evidenziato dall'intensa fluorescenza verde.Al contrario, sotto irradiazione laser, è stata osservata solo la fluorescenza rossa, che conferma l'effettiva fotocitotossicità delle NP RuDA o RuDA.È interessante notare che la fluorescenza verde è apparsa dopo l'aggiunta di Vc, che indica una violazione della fotocitotossicità delle NP RuDA e RuDA.Questi risultati sono coerenti con i saggi di fotocitotossicità in vitro.
Vitalità dose-dipendente delle cellule A RuDA- e B RuDA-NP nelle cellule MDA-MB-231 in presenza o assenza di Vc (0,5 mM), rispettivamente.Barre di errore, media ± deviazione standard (n = 3). Test t a due code spaiati *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Test t a due code spaiati *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Test t a due code non appaiati *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Test t a due code non appaiati *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.C Analisi della colorazione delle cellule vive/morte utilizzando calceina AM e ioduro di propidio come sonde fluorescenti.Barra della scala: 30 µm.Vengono mostrate immagini rappresentative di tre ripetizioni biologiche di ciascun gruppo.D Immagini a fluorescenza confocale della produzione di ROS in cellule MDA-MB-231 in diverse condizioni di trattamento.La fluorescenza DCF verde indica la presenza di ROS.Irradiare con un laser con lunghezza d'onda di 808 nm con una potenza di 0,5 W/cm2 per 10 minuti (300 J/cm2).Barra della scala: 30 µm.Vengono mostrate immagini rappresentative di tre ripetizioni biologiche di ciascun gruppo.E Analisi del trattamento con citometria a flusso RuDA-NPs (50 µM) o RuDA (50 µM) con o senza laser a 808 nm (0,5 W cm-2) in presenza e assenza di Vc (0,5 mM) per 10 min.Vengono mostrate immagini rappresentative di tre ripetizioni biologiche di ciascun gruppo.F Nrf-2, HSP70 e HO-1 di cellule MDA-MB-231 trattate con RuDA-NPs (50 µM) con o senza irradiazione laser a 808 nm (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), le cellule esprimono 2).Vengono mostrate immagini rappresentative di due ripetizioni biologiche di ciascun gruppo.
La produzione intracellulare di ROS nelle cellule MDA-MB-231 è stata esaminata utilizzando il metodo di colorazione 2,7-diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA).Come mostrato in fig.6D, le cellule trattate con RuDA-NPs o RuDA hanno mostrato una fluorescenza verde distinta quando irradiate con il laser a 808 nm, indicando che RuDA-NPs e RuDA hanno un'efficiente capacità di generare ROS.Al contrario, in assenza di luce o in presenza di Vc, si osservava solo un debole segnale fluorescente delle cellule, che indicava una leggera formazione di ROS.I livelli intracellulari di ROS nelle cellule RuDA-NP e nelle cellule MDA-MB-231 trattate con RuDA sono stati ulteriormente determinati mediante citometria a flusso.Come mostrato nella Figura 25 supplementare, l'intensità media della fluorescenza (MFI) generata da RuDA-NPs e RuDA sotto l'irradiazione laser a 808 nm è stata significativamente aumentata di circa 5,1 e 4,8 volte, rispettivamente, rispetto al gruppo di controllo, confermando la loro eccellente formazione AFK.capacità.Tuttavia, i livelli di ROS intracellulari nelle cellule RuDA-NP o MDA-MB-231 trattate con RuDA erano paragonabili solo ai controlli senza irradiazione laser o in presenza di Vc, simili ai risultati dell'analisi della fluorescenza confocale.
È stato dimostrato che i mitocondri sono l'obiettivo principale dei complessi Ru(II)-arene60.Pertanto, è stata studiata la localizzazione subcellulare di RuDA e RuDA-NPs.Come mostrato nella Figura 26 supplementare, RuDA e RuDA-NP mostrano profili di distribuzione cellulare simili con il più alto accumulo nei mitocondri (rispettivamente 62,5 ± 4,3 e 60,4 ± 3,6 ng/mg di proteina).Tuttavia, solo una piccola quantità di Ru è stata trovata nelle frazioni nucleari di Ore e NP Ore (rispettivamente 3,5 e 2,1%).La restante frazione cellulare conteneva rutenio residuo: 31,7% (30,6 ± 3,4 ng/mg di proteine) per RuDA e 42,9% (47,2 ± 4,5 ng/mg di proteine) per RuDA-NPs.In generale, Ore e NP Ore si accumulano principalmente nei mitocondri.Per valutare la disfunzione mitocondriale, abbiamo utilizzato la colorazione JC-1 e MitoSOX Red per valutare rispettivamente il potenziale della membrana mitocondriale e la capacità di produzione di superossido.Come mostrato nella Figura 27 supplementare, è stata osservata una fluorescenza verde intenso (JC-1) e rossa (MitoSOX Red) nelle cellule trattate con RuDA e RuDA-NP sotto irradiazione laser a 808 nm, indicando che sia RuDA che RuDA-NP sono altamente fluorescenti Può indurre efficacemente la depolarizzazione della membrana mitocondriale e la produzione di superossido.Inoltre, il meccanismo di morte cellulare è stato determinato utilizzando l'analisi basata sulla citometria a flusso dell'annessina V-FITC/ioduro di propidio (PI).Come mostrato nella Figura 6E, quando irradiati con laser a 808 nm, RuDA e RuDA-NP hanno indotto un tasso di apoptosi precoce significativamente aumentato (quadrante in basso a destra) nelle cellule MDA-MB-231 rispetto a PBS o PBS più laser.cellule processate.Tuttavia, quando è stato aggiunto Vc, il tasso di apoptosi di RuDA e RuDA-NP è diminuito significativamente dal 50,9% e 52,0% al 15,8% e 17,8%, rispettivamente, il che conferma l'importante ruolo di ROS nella fotocitotossicità di RuDA e RuDA-NP..Inoltre, sono state osservate lievi cellule necrotiche in tutti i gruppi testati (quadrante in alto a sinistra), suggerendo che l'apoptosi potrebbe essere la forma predominante di morte cellulare indotta da RuDA e RuDA-NPs.
Poiché il danno da stress ossidativo è uno dei principali determinanti dell'apoptosi, il fattore nucleare associato all'eritroide 2, il fattore 2 (Nrf2) 62, un regolatore chiave del sistema antiossidante, è stato studiato in MDA-MB-231 trattati con RuDA-NPs.Meccanismo d'azione delle NP RuDA indotto dall'irradiazione.Allo stesso tempo, è stata rilevata anche l'espressione della proteina eme ossigenasi 1 (HO-1) a valle.Come mostrato nella Figura 6F e nella Figura 29 supplementare, la fototerapia mediata da RuDA-NP ha aumentato i livelli di espressione di Nrf2 e HO-1 rispetto al gruppo PBS, indicando che le RuDA-NPs possono stimolare le vie di segnalazione dello stress ossidativo.Inoltre, per studiare l'effetto fototermico di RuDA-NPs63, è stata valutata anche l'espressione della proteina da shock termico Hsp70.È chiaro che le cellule trattate con RuDA-NPs + 808 nm di irradiazione laser hanno mostrato una maggiore espressione di Hsp70 rispetto agli altri due gruppi, riflettendo una risposta cellulare all'ipertermia.
I notevoli risultati in vitro ci hanno spinto a studiare le prestazioni in vivo di RuDA-NP in topi nudi con tumori MDA-MB-231.La distribuzione tissutale delle NP RuDA è stata studiata determinando il contenuto di rutenio nel fegato, nel cuore, nella milza, nei reni, nei polmoni e nei tumori.Come mostrato in fig.7A, il contenuto massimo di Ore NP negli organi normali è apparso al primo tempo di osservazione (4 h), mentre il contenuto massimo è stato determinato nei tessuti tumorali 8 ore dopo l'iniezione, probabilmente a causa di Ore NP.Effetto EPR di LF.Secondo i risultati della distribuzione, la durata ottimale del trattamento con il minerale NP è stata presa 8 ore dopo la somministrazione.Per illustrare il processo di accumulo di RuDA-NP nei siti tumorali, le proprietà fotoacustiche (PA) di RuDA-NP sono state monitorate registrando i segnali PA di RuDA-NP in momenti diversi dopo l'iniezione.Innanzitutto, il segnale PA di RuDA-NP in vivo è stato valutato registrando immagini PA di un sito tumorale dopo l'iniezione intratumorale di RuDA-NP.Come mostrato nella Figura 30 supplementare, i RuDA-NP hanno mostrato un forte segnale PA e c'era una correlazione positiva tra la concentrazione di RuDA-NP e l'intensità del segnale PA (Figura 30A supplementare).Quindi, le immagini PA in vivo dei siti tumorali sono state registrate dopo l'iniezione endovenosa di RuDA e RuDA-NP in diversi momenti dopo l'iniezione.Come mostrato nella Figura 7B, il segnale PA di RuDA-NPs dal sito del tumore è aumentato gradualmente nel tempo e ha raggiunto un plateau a 8 ore dopo l'iniezione, coerentemente con i risultati della distribuzione dei tessuti determinati dall'analisi ICP-MS.Rispetto a RuDA (Figura 30B supplementare), l'intensità massima del segnale PA è apparsa 4 ore dopo l'iniezione, indicando un rapido tasso di ingresso di RuDA nel tumore.Inoltre, il comportamento escretore di RuDA e RuDA-NP è stato studiato determinando la quantità di rutenio nelle urine e nelle feci mediante ICP-MS.La principale via di eliminazione per RuDA (Figura 31 supplementare) e RuDA-NPs (Fig. 7C) è attraverso le feci e durante il periodo di studio di 8 giorni è stata osservata una clearance effettiva di RuDA e RuDA-NP, il che significa che RuDA e le RuDA-NP possono essere eliminate in modo efficiente dal corpo senza tossicità a lungo termine.
A. La distribuzione ex vivo di RuDA-NP nei tessuti di topo è stata determinata dal contenuto di Ru (percentuale della dose somministrata di Ru (ID) per grammo di tessuto) in momenti diversi dopo l'iniezione.I dati sono media ± deviazione standard (n = 3). Test t a due code spaiati *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Test t a due code spaiati *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Test t a due code non appaiati *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Test t a due code non appaiati *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.Immagini B PA di siti tumorali in vivo a 808 nm di eccitazione dopo somministrazione endovenosa di RuDA-NPs (10 µmol kg-1) in diversi momenti.Dopo somministrazione endovenosa di RuDA NPs (10 µmol kg-1), C Ru è stato escreto dai topi con urina e feci a intervalli di tempo diversi.I dati sono media ± deviazione standard (n = 3).
La capacità di riscaldamento di RuDA-NP in vivo è stata studiata in topi nudi con tumori MDA-MB-231 e RuDA per il confronto.Come mostrato in fig.8A e Fig. 32 supplementare, il gruppo di controllo (soluzione salina) ha mostrato una variazione di temperatura minore (ΔT ≈ 3 °C) dopo 10 minuti di esposizione continua.Tuttavia, la temperatura di RuDA-NPs e RuDA è aumentata rapidamente con temperature massime rispettivamente di 55,2 e 49,9 °C, fornendo un'ipertermia sufficiente per la terapia del cancro in vivo.L'aumento osservato della temperatura elevata per le NP RuDA (ΔT ≈ 24°C) rispetto a RuDA (ΔT ≈ 19°C) può essere dovuto alla sua migliore permeabilità e accumulo nei tessuti tumorali a causa dell'effetto EPR.
Immagini termiche a infrarossi di topi con tumori MDA-MB-231 irradiati con laser a 808 nm in tempi diversi 8 ore dopo l'iniezione.Vengono mostrate immagini rappresentative di quattro ripetizioni biologiche di ciascun gruppo.B Volume del tumore relativo e C Massa tumorale media di diversi gruppi di topi durante il trattamento.D Curve dei pesi corporei di diversi gruppi di topi.Irradiare con un laser con lunghezza d'onda di 808 nm con una potenza di 0,5 W/cm2 per 10 minuti (300 J/cm2).Barre di errore, media ± deviazione standard (n = 3). Test t a due code spaiati *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Test t a due code spaiati *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Test t a due code non appaiati *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Test t a due code non appaiati *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. Immagini di colorazione E H&E dei principali organi e tumori provenienti da diversi gruppi di trattamento, inclusi Saline, Saline + Laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs e RuDA-NPs + Laser groups. Immagini di colorazione E H&E dei principali organi e tumori provenienti da diversi gruppi di trattamento, inclusi Saline, Saline + Laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs e RuDA-NPs + Laser groups. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. Immagini di colorazione E H&E dei principali organi e tumori provenienti da diversi gruppi di trattamento, inclusi gruppi salini, salini + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs e RuDA-NPs + Laser.来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E 染色图像，包括盐水、盐水+ 激光、RuDA、RuDA + 激光、RuDA-s NPs +RuDA-NPs来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. Colorazione E H&E dei principali organi e tumori da vari gruppi di trattamento tra cui soluzione salina, soluzione salina + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs e RuDA-NPs + laser.Barra della scala: 60 µm.
È stato valutato l'effetto della fototerapia in vivo con NP RuDA e RuDA in cui topi nudi con tumori MDA-MB-231 sono stati iniettati per via endovenosa con NP RuDA o RuDA a una singola dose di 10,0 µmol kg-1 attraverso la vena della coda, e poi 8 ore dopo l'iniezione.irradiazione laser con lunghezza d'onda di 808 nm.Come mostrato nella Figura 8B, i volumi del tumore sono stati significativamente aumentati nei gruppi di soluzione salina e laser, indicando che l'irradiazione salina o laser 808 ha avuto scarso effetto sulla crescita del tumore.Come nel gruppo salino, è stata osservata anche una rapida crescita del tumore nei topi trattati con RuDA-NPs o RuDA in assenza di irradiazione laser, dimostrando la loro bassa tossicità al buio.Al contrario, dopo l'irradiazione laser, sia il trattamento con RuDA-NP che con RuDA hanno indotto una significativa regressione del tumore con riduzioni del volume del tumore rispettivamente del 95,2% e dell'84,3% rispetto al gruppo trattato con soluzione salina, indicando un'eccellente PDT sinergica., mediato dall'effetto RuDA/CHTV.– NP o Ore. Rispetto a RuDA, le NP RuDA hanno mostrato un migliore effetto fototerapeutico, dovuto principalmente all'effetto EPR delle NP RuDA.I risultati dell'inibizione della crescita tumorale sono stati ulteriormente valutati dal peso del tumore asportato il giorno 15 del trattamento (Fig. 8C e Fig. 33 supplementare).La massa tumorale media nei topi trattati con RuDA-NP e nei topi trattati con RuDA era rispettivamente di 0,08 e 0,27 g, che era molto più leggera rispetto al gruppo di controllo (1,43 g).
Inoltre, il peso corporeo dei topi è stato registrato ogni tre giorni per studiare la tossicità oscura di RuDA-NPs o RuDA in vivo.Come mostrato nella Figura 8D, non sono state osservate differenze significative nel peso corporeo per tutti i gruppi di trattamento. Inoltre, è stata intrapresa la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) degli organi principali (cuore, fegato, milza, polmone e rene) da diversi gruppi di trattamento. Inoltre, è stata eseguita la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) degli organi principali (cuore, fegato, milza, polmone e rene) da diversi gruppi di trattamento. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения. Inoltre, è stata eseguita la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) degli organi principali (cuore, fegato, milza, polmoni e reni) da diversi gruppi di trattamento.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行苏木精和伊红(H&E) 染色。 (LUI) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) в различных группах лечения. Inoltre, la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) degli organi principali (cuore, fegato, milza, polmone e rene) è stata eseguita in diversi gruppi di trattamento.Come mostrato in Fig.8E, le immagini di colorazione H&E di cinque organi principali dei gruppi RuDA-NP e RuDA non mostrano anomalie evidenti o danni agli organi. 8E, le immagini di colorazione H&E di cinque organi principali dei gruppi RuDA-NP e RuDA non mostrano anomalie evidenti o danni agli organi.Come mostrato in fig.8E, изображения окрашивания H&E пяти основных органов из групп RuDA-NPs и RuDA не демонстрируют явных аномалий или повреждений органов. 8E, le immagini di colorazione H&E di cinque organi principali dei gruppi RuDA-NPs e RuDA non mostrano anomalie o lesioni evidenti degli organi.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示出明显的异常或器官损明显的异常或器官损如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Как показано на рисунке 8E, изображения окрашивания H&E пяти основных органов из групп RuDA-NPs и RuDA не показали явных аномалий или повреждения органов. Come mostrato nella Figura 8E, le immagini di colorazione H&E dei cinque organi principali dei gruppi RuDA-NP e RuDA non hanno mostrato anomalie evidenti o danni agli organi.Questi risultati hanno mostrato che né RuDA-NP né RuDA hanno mostrato segni di tossicità in vivo. Inoltre, le immagini di colorazione H&E dei tumori hanno mostrato che entrambi i gruppi RuDA + Laser e RuDA-NPs + Laser potrebbero causare una grave distruzione delle cellule tumorali, dimostrando l'eccellente efficacia fototerapeutica in vivo di RuDA e RuDA-NPs. Inoltre, le immagini di colorazione H&E dei tumori hanno mostrato che entrambi i gruppi RuDA + Laser e RuDA-NPs + Laser potrebbero causare una grave distruzione delle cellule tumorali, dimostrando l'eccellente efficacia fototerapeutica in vivo di RuDA e RuDA-NPs.Inoltre, le immagini del tumore colorate con ematossilina-eosina hanno mostrato che entrambi i gruppi RuDA+Laser e RuDA-NPs+Laser possono indurre una grave distruzione delle cellule tumorali, dimostrando la superiore efficacia fototerapeutica di RuDA e RuDA-NP in vivo.此外 ， 肿瘤 的 h & e 染色 图像 显示 ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 可 导致 严重 的 癌细胞 破坏 ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 优异 的 体内 光疗 功效 功效 功效此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 导致 的 癌 细胞 破坏 ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 体内 光疗。。。Inoltre, le immagini del tumore colorate con ematossilina ed eosina hanno mostrato che entrambi i gruppi RuDA+Laser e RuDA-NPs+Laser hanno provocato una grave distruzione delle cellule tumorali, dimostrando un'efficacia fototerapeutica superiore di RuDA e RuDA-NPs in vivo.
In conclusione, il complesso organometallico Ru(II)-arene (RuDA) con ligandi di tipo DA è stato progettato per facilitare il processo ISC utilizzando il metodo di aggregazione.RuDA sintetizzato può autoassemblarsi attraverso interazioni non covalenti per formare sistemi supramolecolari derivati ​​​​da RuDA, facilitando così la formazione di 1O2 e un'efficiente conversione fototermica per la terapia del cancro indotta dalla luce.È interessante notare che il RuDA monomerico non ha generato 1O2 sotto irradiazione laser a 808 nm, ma potrebbe generare una grande quantità di 1O2 nello stato aggregato, dimostrando la razionalità e l'efficienza del nostro progetto.Studi successivi hanno dimostrato che l'assemblaggio supramolecolare conferisce a RuDA proprietà fotofisiche e fotochimiche migliorate, come l'assorbimento del redshift e la resistenza al fotosbiancamento, che sono altamente desiderabili per l'elaborazione PDT e PTT.Sia gli esperimenti in vitro che quelli in vivo hanno dimostrato che le NP RuDA con buona biocompatibilità e buon accumulo nel tumore mostrano un'eccellente attività antitumorale indotta dalla luce all'irradiazione laser a una lunghezza d'onda di 808 nm.Pertanto, le NP RuDA come efficaci reagenti PDT/PTW bimodali supramolecolari arricchiranno l'insieme di fotosensibilizzatori attivati ​​a lunghezze d'onda superiori a 800 nm.Il design concettuale del sistema supramolecolare fornisce un percorso efficiente per fotosensibilizzanti NIR-attivati ​​con eccellenti effetti fotosensibilizzanti.
Tutti i prodotti chimici e i solventi sono stati ottenuti da fornitori commerciali e utilizzati senza ulteriore purificazione.RuCl3 è stato acquistato da Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, Cina).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolina-5,6-dione) e 4,7-bis[4-(N,N-difenilammino)fenil]-5 Il ,6-Diamino-2,1,3-benzotiadiazolo è stato sintetizzato secondo studi precedenti64,65.Gli spettri NMR sono stati registrati su uno spettrometro Bruker Avance III-HD 600 MHz presso il Southeastern University Analytical Test Center utilizzando d6-DMSO o CDCl3 come solvente.Gli spostamenti chimici δ sono espressi in ppm.rispetto al tetrametilsilano e le costanti di interazione J sono date in valori assoluti in hertz.La spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) è stata eseguita su uno strumento MS Agilent 6224 ESI/TOF.L'analisi elementare di C, H e N è stata eseguita su un analizzatore elementare Vario MICROCHNOS (Elementar).Gli spettri UV-visibili sono stati misurati su uno spettrofotometro Shimadzu UV3600.Gli spettri di fluorescenza sono stati registrati su uno spettrofluorimetro Shimadzu RF-6000.Gli spettri EPR sono stati registrati su uno strumento Bruker EMXmicro-6/1.La morfologia e la struttura dei campioni preparati sono state studiate su strumenti FEI Tecnai G20 (TEM) e Bruker Icon (AFM) operanti ad una tensione di 200 kV.La diffusione dinamica della luce (DLS) è stata eseguita su un analizzatore Nanobrook Omni (Brookhaven).Le proprietà fotoelettrochimiche sono state misurate su una configurazione elettrochimica (CHI-660, Cina).Le immagini fotoacustiche sono state ottenute utilizzando il sistema FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.Le immagini confocali sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale Olympus FV3000.L'analisi FACS è stata eseguita su un citometro a flusso BD Calibur.Gli esperimenti di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) sono stati eseguiti su un sistema Waters Alliance e2695 utilizzando un rivelatore UV/Vis 2489.I test di cromatografia a permeazione di gel (GPC) sono stati registrati su uno strumento Thermo ULTIMATE 3000 utilizzando un rilevatore di indice di rifrazione RefratoMax520 ERC.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolina-5,6-dione)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4 -(N, N-difenilammino)fenil]-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazolo 65 (652,0 mg, 1,0 mmoli) e acido acetico glaciale (30 mL) sono stati agitati in frigorifero a riflusso per 12 ore.Il solvente è stato quindi rimosso sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotante.Il residuo risultante è stato purificato mediante cromatografia su colonna flash (gel di silice, CH2Cl2:MeOH=20:1) per ottenere RuDA come polvere verde (resa: 877,5 mg, 80%).ano.Calcolato per C64H48Cl2N8RuS: C 67.84, H 4.27, N 9.89.Trovato: C 67.92, H 4.26, N 9.82.1H NMR (600 MHz, d6-DMSO) δ 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13c nmr (150 MHZ, D6-DMSO), δ (PPM) 158.03, 152.81, 149.31, 147.98, 147.16, 139.98, 136.21, 135.57, 134.68, 130.34, 130.02, 128.68, 128.01, 125.51, 124.45, 120.81, 103.49, 103.49 , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Sintesi di 4,7-bis[4-(N,N-dietilammino)fenil-5,6-diammino-2,1,3-benzotiadiazolo (L2): L2 è stato sintetizzato in due fasi.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmoli) è stato aggiunto alla soluzione di N,N-dietil-4-(tributilstannil)anilina (1,05 g, 2,4 mmoli) e 4,7-dibromo-5,6-dinitro - 2, 1,3-benzotiadiazolo (0,38 g, 1,0 mmol) in toluene secco (100 ml).La miscela è stata agitata a 100°C per 24 ore.Dopo aver rimosso il toluene sotto vuoto, il solido risultante è stato lavato con etere di petrolio.Quindi una miscela di questo composto (234,0 mg, 0,45 mmoli) e polvere di ferro (0,30 g, 5,4 mmoli) in acido acetico (20 ml) è stata agitata a 80°C per 4 ore.La miscela di reazione è stata versata in acqua e il solido marrone risultante è stato raccolto mediante filtrazione.Il prodotto è stato purificato due volte mediante sublimazione sotto vuoto per dare un solido verde (126,2 mg, resa del 57%).ano.Calcolato per C26H32N6S: C 67.79, H 7.00, N 18.24.Trovato: C 67.84, H 6.95, H 18.16.1H NMR (600 MHz, CDCl3), δ (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H ), 1,22 (s, 12H).13С NMR (150 MHz, CDCl3), δ (ppm) 151.77, 147.39, 138.07, 131.20, 121.09, 113.84, 111.90, 44.34, 12.77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
I composti sono stati preparati e purificati seguendo procedure simili a RuDA.ano.Calcolato per C48H48Cl2N8RuS: C 61.27, H 5.14, N 11.91.Trovato: C, 61.32, H, 5.12, N, 11.81,1H NMR (600 MHz, d6-DMSO), δ (ppm) 10.19 (s, 2H), 9.28 (s, 2H), 8.09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13C NMR (151 MHz, Cdcl3), Δ (ppm) 158.20, 153.36, 148.82, 148.14, 138.59, 136.79, 135.75, 134.71, 130.44, 128.87, 128.35, 121.70, 111.84, 110.76, 104.23, 104.23, 87.4.4., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA è stato sciolto in MeOH/H2O (5/95, v/v) ad una concentrazione di 10 μM.Lo spettro di assorbimento di RuDA è stato misurato ogni 5 minuti su uno spettrofotometro Shimadzu UV-3600 sotto irraggiamento con luce laser con una lunghezza d'onda di 808 nm (0,5 W/cm2).Gli spettri ICG sono stati registrati nelle stesse condizioni dello standard.
Gli spettri EPR sono stati registrati su uno spettrometro Bruker EMXmicro-6/1 con una potenza delle microonde di 20 mW, un range di scansione di 100 G e una modulazione di campo di 1 G. 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidone (TEMP) e 5,5-dimetil-1-pirrolina N-ossido (DMPO) sono stati usati come trappole di spin.Gli spettri di risonanza dello spin elettronico sono stati registrati per soluzioni miste di RuDA (50 µM) e TEMF (20 mM) o DMPO (20 mM) sotto l'azione della radiazione laser con una lunghezza d'onda di 808 nm (0,5 W/cm2).
I calcoli DFT e TD-DFT per RuDA sono stati eseguiti a livelli PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ in soluzione acquosa utilizzando il programma gaussiano 1666,67,68.Le distribuzioni HOMO-LUMO, lacuna ed elettronica dello stato eccitato di singoletto a bassa energia RuDA sono state tracciate utilizzando il programma GaussView (versione 5.0).
Per prima cosa abbiamo provato a misurare l'efficienza di generazione di 1O2 RuDA utilizzando la spettroscopia UV-visibile convenzionale con ICG (ΦΔ = 0,002) come standard, ma la fotodegradazione dell'ICG ha fortemente influenzato i risultati.Pertanto, la resa quantica di 1O2 RuDA è stata misurata rilevando un cambiamento nell'intensità della fluorescenza ABDA a circa 428 nm quando irradiata con un laser con una lunghezza d'onda di 808 nm (0,5 W/cm2).Gli esperimenti sono stati eseguiti su RuDA e RuDA NP (20 μM) in acqua/DMF (98/2, v/v) contenente ABDA (50 μM).La resa quantica di 1O2 è stata calcolata utilizzando la seguente formula: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS e rICG sono le velocità di reazione di ABDA con 1O2 ottenute rispettivamente dal fotosensibilizzante e dall'ICG.APS e AICG sono rispettivamente l'assorbanza del fotosensibilizzante e dell'ICG a 808 nm.
Le misurazioni AFM sono state eseguite in condizioni liquide utilizzando la modalità di scansione su un sistema AFM Bruker Dimension Icon.Utilizzando una struttura aperta con cellule liquide, le cellule sono state lavate due volte con etanolo ed essiccate con un flusso di azoto.Inserire le cellule essiccate nella testa ottica del microscopio.Mettere immediatamente una goccia del campione nella pozza di liquido e posizionarla sul cantilever utilizzando una siringa sterile di plastica monouso e un ago sterile.Un'altra goccia viene posizionata direttamente sul campione e quando la testina ottica viene abbassata, le due gocce si fondono formando un menisco tra il campione e il serbatoio del liquido.Le misurazioni AFM sono state eseguite utilizzando un cantilever in nitruro a forma di V SCANASYST-FLUID (Bruker, durezza k = 0,7 N m-1, f0 = 120–180 kHz).
I cromatogrammi HPLC sono stati ottenuti su un sistema Waters e2695 dotato di una colonna phoenix C18 (250×4,6 mm, 5 µm) utilizzando un rivelatore 2489 UV/Vis.La lunghezza d'onda del rivelatore è 650 nm.Le fasi mobili A e B erano rispettivamente acqua e metanolo e la portata della fase mobile era di 1,0 ml·min-1.Il gradiente (solvente B) era il seguente: 100% da 0 a 4 minuti, 100% a 50% da 5 a 30 minuti e ripristinato al 100% da 31 a 40 minuti.Il minerale è stato sciolto in una soluzione mista di metanolo e acqua (50/50, in volume) ad una concentrazione di 50 μM.Il volume di iniezione era di 20 μl.
I saggi GPC sono stati registrati su uno strumento Thermo ULTIMATE 3000 dotato di due colonne PL aquagel-OH MIXED-H (2×300×7,5 mm, 8 µm) e un rivelatore di indice di rifrazione ERC RefratoMax520.La colonna GPC è stata eluita con acqua ad una portata di 1 ml/min a 30°C.I minerali NP sono stati sciolti in una soluzione di PBS (pH = 7,4, 50 μM), il volume di iniezione era di 20 μL.
Le fotocorrenti sono state misurate su una configurazione elettrochimica (CHI-660B, Cina).Le risposte optoelettroniche all'accensione e allo spegnimento del laser (808 nm, 0,5 W/cm2) sono state misurate rispettivamente a una tensione di 0,5 V in una scatola nera.Una cella standard a tre elettrodi è stata utilizzata con un elettrodo di carbonio vetroso (GCE) a forma di L come elettrodo di lavoro, un elettrodo calomelano standard (SCE) come elettrodo di riferimento e un disco di platino come controelettrodo.Come elettrolita è stata utilizzata una soluzione di Na2SO4 0,1 M.
La linea cellulare di cancro al seno umano MDA-MB-231 è stata acquistata da KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanchino, Cina, numero di catalogo: KG033).Le cellule sono state coltivate in monostrati in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, alto glucosio) integrato con una soluzione al 10% di siero bovino fetale (FBS), penicillina (100 μg/ml) e streptomicina (100 μg/ml).Tutte le cellule sono state coltivate a 37°C in un'atmosfera umida contenente il 5% di CO2.
Il test MTT è stato utilizzato per determinare la citotossicità di RuDA e RuDA-NPs in presenza e assenza di irradiazione di luce, con o senza Vc (0,5 mM).Le cellule tumorali MDA-MB-231 sono state coltivate in piastre da 96 pozzetti a una densità cellulare di circa 1 x 105 cellule/ml/pozzetto e incubate per 12 ore a 37,0°C in un'atmosfera al 5% di CO2 e al 95% di aria.Alle cellule sono state aggiunte le NP RuDA e RuDA disciolte in acqua.Dopo 12 ore di incubazione, le cellule sono state esposte a una radiazione laser di 0,5 W cm -2 a una lunghezza d'onda di 808 nm per 10 minuti (300 J cm -2) e quindi incubate al buio per 24 ore.Le cellule sono state quindi incubate con MTT (5 mg/ml) per altre 5 ore.Infine, cambiare il mezzo in DMSO (200 ml) per dissolvere i cristalli di formazano viola risultanti.I valori OD sono stati misurati utilizzando un lettore di micropiastre con una lunghezza d'onda di 570/630 nm.Il valore IC50 per ciascun campione è stato calcolato utilizzando il software SPSS dalle curve dose-risposta ottenute da almeno tre esperimenti indipendenti.
Le cellule MDA-MB-231 sono state trattate con RuDA e RuDA-NP a una concentrazione di 50 μM.Dopo 12 ore di incubazione, le cellule sono state irradiate con un laser con una lunghezza d'onda di 808 nm e una potenza di 0,5 W/cm2 per 10 minuti (300 J/cm2).Nel gruppo vitamina C (Vc), le cellule sono state trattate con 0,5 mM Vc prima dell'irradiazione laser.Le cellule sono state quindi incubate al buio per altre 24 ore, quindi colorate con calceina AM e ioduro di propidio (20 μg/ml, 5 μl) per 30 minuti, quindi lavate con PBS (10 μl, pH 7,4).immagini di cellule colorate.