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I metodi di etichettatura di prossimità enzimatica basati su esteri attivati ​​o radicali fenossilici sono ampiamente utilizzati per mappare i proteomi subcellulari e gli interattori proteici nelle cellule viventi.Tuttavia, gli esteri attivati ​​sono meno reattivi, risultando in un ampio raggio di etichettatura, e i radicali fenossi generati dal trattamento con perossido possono interferire con le vie redox.Qui riportiamo un metodo di fotoattivazione dipendente dall'etichettatura di prossimità (PDPL) sviluppato collegando geneticamente la proteina fotosensibilizzante miniSOG a una proteina di interesse.Attivato dalla luce blu e controllato dal tempo di esposizione, viene generato ossigeno singoletto e quindi si ottiene l'etichettatura dei residui di istidina risolta nello spazio temporale dalla sonda di anilina.Dimostriamo la sua alta fedeltà attraverso la mappatura del proteoma specifico dell'organello.Un confronto fianco a fianco di PDPL con TurboID mostra una copertura proteomica più specifica e completa di PDPL.Successivamente, abbiamo applicato PDPL al coattivatore trascrizionale associato alla malattia BRD4 e E3 Parkin ligasi e abbiamo trovato interattori precedentemente sconosciuti.Mediante lo screening della sovraespressione, sono stati identificati due substrati sconosciuti, Ssu72 e SNW1, per Parkin, la cui degradazione è mediata dalla via dell'ubiquitinazione-proteasoma.
L'accurata caratterizzazione delle reti proteiche è alla base di molti processi cellulari fondamentali.Pertanto, una mappatura spaziotemporale altamente accurata delle interazioni proteiche fornirà una base molecolare per decifrare i percorsi biologici, la patologia della malattia e interrompere queste interazioni a fini terapeutici.A tal fine, sono altamente desiderabili metodi in grado di rilevare le interazioni temporali in cellule o tessuti viventi.La spettrometria di massa di purificazione dell'affinità (AP-MS) è stata storicamente utilizzata per identificare i partner di legame delle proteine ​​di interesse (POI).Con lo sviluppo di metodi di proteomica quantitativa, è stato creato Bioplex3.0, il più grande database di reti proteiche basato su AP-MS.Sebbene AP-MS sia molto potente, le fasi di lisi cellulare e diluizione nel flusso di lavoro sono orientate verso interazioni di legame deboli e transitorie e introducono artefatti post-lisi come coppie di interazioni spurie prive di compartimentazione prima della lisi.
Per affrontare questi problemi, sono stati sviluppati aminoacidi innaturali (SAU) con gruppi di reticolazione e piattaforme di etichettatura enzimatica nelle vicinanze (PL) (ad esempio APEX e BioID)5.Sebbene il metodo UAA sia stato applicato con successo in molti scenari e fornisca informazioni sugli adesivi proteici diretti, è ancora necessaria l'ottimizzazione del sito di inserimento dell'UAA.Ancora più importante, è un metodo di etichettatura stechiometrico che manca di un'inversione catalitica degli eventi di etichettatura.Al contrario, i metodi enzimatici PL, come il metodo BioID, fondono la biotina ligasi ingegnerizzata con POI7, che successivamente attiva la biotina per formare un intermedio reattivo dell'estere biotinil-AMP.L'enzima quindi catalizza e rilascia una "nuvola" di biotina attivata che etichetta i residui di lisina prossimali.Tuttavia, BioID richiede più di 12 ore per ottenere un segnale etichettato sufficiente, che ne preclude l'uso con risoluzione temporale.Utilizzando l'evoluzione diretta basata sulla visualizzazione del lievito, TurboID è stato progettato sulla base di BioID per essere più efficiente, consentendo un'etichettatura efficiente con la biotina entro 10 minuti, consentendo lo studio di processi più dinamici.Poiché TurboID è altamente attivo e i livelli di biotina endogena sono sufficienti per l'etichettatura di basso livello, l'etichettatura di fondo diventa un potenziale problema quando è richiesta un'etichettatura altamente potenziata e temporizzata mediante l'aggiunta di biotina esogena.Inoltre, gli esteri attivati ​​sono scarsamente reattivi (t1/2 ~ 5 min), il che può portare a un ampio raggio di etichettatura, specialmente dopo la saturazione delle proteine ​​​​vicine con la biotina 5. In un altro approccio, la fusione genetica della perossidasi di ascorbato ingegnerizzata (cioè biotina- radicali fenolici e consente l'etichettatura delle proteine ​​entro un minuto 9,10. APEX è ampiamente utilizzato per identificare proteomi subcellulari, complessi proteici di membrana e complessi proteici di segnalazione citosolici 11, 12. Tuttavia, la necessità di alte concentrazioni di perossidi può influenzare le proteine ​​​​o le vie redox, interrompendo processi cellulari.
Pertanto, un nuovo metodo in grado di generare specie di soppressione del raggio etichettate più reattive con un'elevata precisione spaziale e temporale senza interrompere in modo significativo i percorsi cellulari sarà un'aggiunta importante ai metodi esistenti. Tra le specie reattive, l'ossigeno singoletto ha destato la nostra attenzione a causa della sua breve durata e del limitato raggio di diffusione (t1/2 < 0,6 µs nelle cellule)13. Tra le specie reattive, l'ossigeno singoletto ha destato la nostra attenzione a causa della sua breve durata e del limitato raggio di diffusione (t1/2 < 0,6 µs nelle cellule)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Tra le forme attive, l'ossigeno singoletto ha attirato la nostra attenzione a causa della sua breve durata e del raggio di diffusione limitato (t1/2 < 0,6 µs nelle cellule)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Tra le forme attive, l'ossigeno singoletto attira la nostra attenzione a causa della sua breve durata e del raggio di diffusione limitato (t1/2 < 0,6 μs nelle cellule).È stato riportato che l'ossigeno singoletto ossida casualmente metionina, tirosina, istidina e triptofano, rendendolo polare 14,15 per l'attacco a sonde a base di ammina o tiolo16,17.Sebbene l'ossigeno singoletto sia stato utilizzato per etichettare l'RNA del compartimento subcellulare, le strategie per riproporre i marcatori di prossimità dei POI endogeni rimangono inesplorate.Qui presentiamo una piattaforma chiamata etichettatura di prossimità dipendente dalla fotoattivazione (PDPL), in cui utilizziamo la luce blu per illuminare i POI fusi con un fotosensibilizzante miniSOG e attivare la generazione di ossigeno singoletto per ossidare i residui prossimali, seguita da modifiche contenenti ammine per ossidare le sonde chimiche in cellule viventi intermedie..Abbiamo testato un gruppo di sonde chimiche per massimizzare la specificità dei tag e identificato i siti di modifica utilizzando un flusso di lavoro di proteomica aperto.Un confronto fianco a fianco di PDPL con TurboID mostra una copertura proteomica più specifica e completa di PDPL.Abbiamo applicato questo approccio ai marcatori specifici dell'organello del proteoma subcellulare e all'identificazione generale del proteoma dei partner di legame per la proteina regolatoria epigenetica associata al cancro BRD4 e la ligasi E3 associata al morbo di Parkinson Parkin, che ha confermato sia una rete di proteine ​​nota che sconosciuta interazioni..La capacità del PDPL di riconoscere substrati E3 in grandi complessi proteici rappresenta una situazione in cui è richiesto il riconoscimento dei leganti indiretti.Sono stati confermati in situ due substrati di parkina sconosciuti mediati dall'ubiquitinazione-proteasoma.
La terapia fotodinamica (PDT)19 e l'inattivazione laser assistita da cromoforo (CALI)20, in cui l'irradiazione della luce con fotosensibilizzanti genera ossigeno singoletto, può inattivare le proteine ​​bersaglio o causare la morte cellulare.Poiché l'ossigeno singoletto è una sostanza altamente reattiva con una distanza di diffusione teorica di circa 70 nm, è possibile controllare l'ossidazione spazialmente limitata attorno al fotosensibilizzante.Sulla base di questo concetto, abbiamo deciso di utilizzare l'ossigeno singoletto per ottenere una stretta etichettatura dei complessi proteici nelle cellule viventi.Abbiamo sviluppato un approccio chemioproteomico PDPL per svolgere quattro funzioni: (1) catalizzare la generazione di ossigeno singoletto attivo simile all'approccio enzimatico PL;(2) fornire un'etichettatura risolta nel tempo all'accensione della luce;(3) per alterazione (4) Evitare l'uso di cofattori endogeni (come la biotina) per ridurre il fondo o utilizzare reagenti esogeni altamente perturbatori (come i perossidi) per ridurre al minimo l'esposizione cellulare allo stress ambientale.
I fotosensibilizzanti possono essere suddivisi in due categorie, inclusi i fluorofori di piccolo peso molecolare (es. rosa bengala, blu di metilene)22 e le piccole proteine ​​geneticamente codificate (es. miniSOG, KillerRed)23.Per ottenere un design modulare, abbiamo sviluppato la piattaforma PDPL di prima generazione aggiungendo proteine ​​fotosensibilizzanti (PS) a POI24,25 (Figura 1a).Quando irradiato con luce blu, l'ossigeno singoletto ossida i residui di amminoacidi nucleofili prossimali, determinando una polarità dell'umpolung che è elettrofila e può reagire ulteriormente con i nucleofili della sonda amminica16,17.La sonda è progettata con un'impugnatura in alchino per consentire la chimica del clic e l'abbassamento per la caratterizzazione LC/MS/MS.
Illustrazione schematica dell'etichettatura di complessi proteici mediata da miniSOG.Se esposte alla luce blu, le cellule che esprimono miniSOG-POI generano ossigeno singoletto, che modifica le proteine ​​interagenti ma non le proteine ​​non leganti.I prodotti intermedi della fotoossidazione vengono intercettati dalle etichette relè della sonda chimica dell'ammina per formare addotti covalenti.Il gruppo alchinile sulla sonda chimica consente la chimica del clic per l'arricchimento mediante pull-down seguito dalla quantificazione LC-MS/MS.b Struttura chimica delle sonde amminiche 1-4.c Analisi rappresentativa del gel fluorescente di marcatori proteomici mediati da miniSOG localizzati mitocondriali utilizzando le sonde 1-4 e la quantificazione relativa basata sulla densitometria su gel.Il rapporto segnale-sfondo delle sonde chimiche è stato valutato utilizzando esperimenti di controllo negativo escludendo la luce blu o utilizzando cellule HEK293T senza espressione miniSOG.n = 2 campioni biologicamente indipendenti.Ogni punto rappresenta una replica biologica.d Rilevamento rappresentativo e quantificazione del PDPL utilizzando la sonda ottimizzata 3 in presenza o assenza dei componenti PDPL indicati come c.n = 3 campioni biologicamente indipendenti.Ogni punto rappresenta una replica biologica.Le linee centrali e i baffi rappresentano la media e ± deviazione standard.CBB: Coomassie Blu brillante.e Imaging confocale dell'ossigeno singoletto con colorazione Si-DMA in rosso lontano.Barra della scala: 10 µm.Gli esperimenti di gel imaging e confocale sono stati ripetuti indipendentemente almeno due volte con risultati simili.
Per prima cosa abbiamo testato la capacità dei fotosensibilizzatori maturi miniSOG26 e KillerRed23, stabilmente espressi in HEK293T, di mediare l'etichettatura della propargilammina del proteoma come sonda chimica (Figura 1a supplementare).L'analisi della fluorescenza del gel ha mostrato che l'etichettatura dell'intero proteoma è stata ottenuta utilizzando miniSOG e irradiazione di luce blu, mentre non è stato osservato alcun prodotto di etichettatura visibile con KillerRed.Per migliorare il rapporto segnale-fondo, abbiamo quindi testato una serie di sonde chimiche contenenti anilina (1 e 3), propilammina (2) o benzilammina (4).Abbiamo osservato che le stesse cellule HEK293T avevano un segnale di fondo più elevato rispetto all'assenza di luce blu, probabilmente a causa del fotosensibilizzante riboflavina endogeno, flavin mononucleotide (FMN) 27. Le sonde chimiche a base di anilina 1 e 3 hanno fornito una migliore specificità, con HEK293T che esprime stabilmente miniSOG nei mitocondri che mostra un aumento di > 8 volte del segnale per la sonda 3, mentre la sonda 2 utilizzata nel metodo di etichettatura dell'RNA CAP-seq mostra solo ~ 2,5- aumento del segnale di piega, probabilmente a causa delle diverse preferenze di reattività tra RNA e proteina (Fig. 1b, c). Le sonde chimiche a base di anilina 1 e 3 hanno fornito una migliore specificità, con HEK293T che esprime stabilmente miniSOG nei mitocondri che mostra un aumento di > 8 volte del segnale per la sonda 3, mentre la sonda 2 utilizzata nel metodo di etichettatura dell'RNA CAP-seq mostra solo ~ 2,5- aumento del segnale di piega, probabilmente a causa delle diverse preferenze di reattività tra RNA e proteina (Fig. 1b, c).Le sonde chimiche a base di anilina 1 e 3 hanno mostrato una migliore specificità: HEK293T, che esprime stabilmente miniSOG nei mitocondri, mostra un aumento del segnale di oltre 8 volte per la sonda 3, mentre la sonda 2, utilizzata nel metodo di etichettatura dell'RNA CAP-seq, solo mostra un aumento del segnale di circa 2,5 volte, probabilmente a causa delle diverse preferenze di reattività tra RNA e proteine ​​(Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， hek293t 在 线 粒体 中 中 表达 minisog ， 探针 3 的 信号> 8 倍 ， 而 用 于 rna 标记 方法 cap-seq 的 探针 2 仅 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 tivamente. 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNALe sonde chimiche a base di anilina 1 e 3 avevano una migliore specificità, HEK293T esprimeva stabilmente miniSOG nei mitocondri e la sonda 3 aveva un aumento del segnale di oltre 8 volte, mentre la sonda 2 per il metodo di etichettatura dell'RNA CAP-seq ha mostrato solo ~ 2,5 volte aumento.nel segnale, probabilmente a causa delle diverse preferenze di reazione tra RNA e proteina (Fig. 1b, c).Inoltre, sono stati testati gli isomeri della sonda 3 e le sonde di idrazina (sonde 5, 6, 7), confermando l'ottimizzazione della sonda 3 (Figura 1b, c supplementare).Allo stesso modo, l'analisi della fluorescenza in gel ha rivelato altri parametri sperimentali ottimizzati: lunghezza d'onda di irradiazione (460 nm), concentrazione della sonda chimica (1 mM) e tempo di irradiazione (20 min) (Figura 2a-c supplementare).L'omissione di qualsiasi componente o passaggio nel protocollo PDPL ha comportato una significativa inversione del segnale in background (Fig. 1d).In particolare, l'etichettatura delle proteine ​​è stata significativamente ridotta in presenza di sodio azide o trolox, che sono noti per estinguere l'ossigeno singoletto.La presenza di D2O, noto per stabilizzare l'ossigeno singoletto, migliora il segnale di etichettatura.Per studiare il contributo di altre specie reattive dell'ossigeno all'etichettatura, sono stati aggiunti mannitolo e vitamina C per stabilire scavenger di radicali ossidrile e superossido, rispettivamente, 18, 29, ma non è stato riscontrato che riducano l'etichettatura.L'aggiunta di H2O2, ma non l'illuminazione, non ha comportato l'etichettatura (Figura 3a supplementare).L'imaging dell'ossigeno singoletto a fluorescenza con sonde Si-DMA ha confermato la presenza di ossigeno singoletto nel filo HEK293T-miniSOG, ma non nel filo HEK293T originale.Inoltre, mitoSOX Red non è stato in grado di rilevare la produzione di superossido dopo l'illuminazione (Fig. 1e e Fig. 3b supplementare) 30. Questi dati suggeriscono fortemente che l'ossigeno singoletto è la principale specie reattiva dell'ossigeno responsabile della successiva etichettatura proteomica.È stata valutata la citotossicità del PDPL inclusa l'irradiazione della luce blu e le sonde chimiche e non è stata osservata alcuna citotossicità significativa (Figura 4a supplementare).
Per studiare il meccanismo di etichettatura e consentire l'identificazione proteomica dei complessi proteici utilizzando LC-MS/MS, dobbiamo prima determinare quali amminoacidi vengono modificati e la massa delta delle etichette delle sonde.Metionina, istidina, triptofano e tirosina sono state modificate dall'ossigeno singoletto14,15.Integriamo il flusso di lavoro TOP-ABPP31 con la ricerca aperta imparziale fornita dalla piattaforma informatica FragPipe basata su MSFragger32.Dopo la modifica dell'ossigeno singoletto e l'etichettatura della sonda chimica, la chimica del clic è stata eseguita utilizzando un'etichetta di riduzione della biotina contenente un linker scindibile, seguita da allungamento della neutravidina e digestione della tripsina.Il peptide modificato, ancora legato alla resina, è stato fotoclivato per l'analisi LC-MS/MS (Figura 2a e Dati supplementari 1).Un gran numero di modifiche si è verificato in tutto il proteoma con oltre 50 corrispondenze della mappa peptidica (PSM) elencate (Fig. 2b).Sorprendentemente, abbiamo osservato solo una modifica dell'istidina, probabilmente a causa della maggiore reattività dell'istidina ossidata nei confronti delle sonde dell'anilina rispetto ad altri aminoacidi.Secondo il meccanismo pubblicato dell'ossidazione dell'istidina mediante ossigeno singoletto,21,33 la struttura della massa delta proposta di +229 Da corrisponde all'addotto della sonda 3 con 2-osso-istidina dopo due ossidazioni, mentre +247 Da è il prodotto dell'idrolisi di +229 Da (Supplementare Fig. 5).La valutazione dello spettro MS2 ha mostrato un'elevata affidabilità nell'identificazione della maggior parte degli ioni y e b, inclusa l'identificazione di frammenti di ioni modificati (y e b) (Fig. 2c).L'analisi del contesto della sequenza locale delle istidine modificate con PDPL ha rivelato una moderata preferenza del motivo per piccoli residui idrofobici a ± 1 posizioni (Figura 4b supplementare).In media, sono state identificate 1,4 istidine per proteina e i siti di questi marcatori sono stati determinati mediante analisi della superficie accessibile al solvente (SASA) e della disponibilità relativa del solvente (RSA) (Figura 4c, d supplementare).
Un flusso di lavoro imparziale per lo studio della selettività residua utilizzando la piattaforma di elaborazione FragPipe basata su MSFragger.I linker clivabili vengono utilizzati nella chimica Click per consentire il fotoclivaggio dei peptidi modificati dalla resina di streptavidina.È stata avviata una ricerca aperta per identificare numerose modifiche, nonché i resti rilevanti.b Assegnare la massa delle modifiche che si verificano in tutto il proteoma.Mappatura dei peptidi PSM.c Annotazione spettrale MS2 dei siti di istidina modificati con la sonda 3. Come esempio rappresentativo, una reazione covalente con la sonda 3 ha aggiunto +229,0938 Da all'amminoacido modificato.d Saggio di mutazione utilizzato per testare i marcatori PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) e PRDX1 (H10A, H81A, H169A) sono stati trasfettati con plasmidi wild-type per il rilevamento anti-Flag.e Il peptide sintetico è stato fatto reagire con miniSOG purificato in presenza della sonda 3 e nello spettro LC-MS sono stati osservati i prodotti corrispondenti con Δm +247 e +229.f Interazioni proteina-proteina in vitro modellate con miniSOG-6xHis-tag e anticorpo anti-6xHis.Antibiotina (streptavidina-HRP) e analisi Western blot anti-topo di complessi anticorpali miniSOG-6xHis/anti-6xHis marcati con la sonda 3, a seconda del tempo di esposizione alla luce.Le etichette per le singole proteine ​​sono espresse nel corrispondente peso molecolare: catena leggera dell'anticorpo LC, catena pesante dell'anticorpo HC.Questi esperimenti sono stati ripetuti indipendentemente almeno due volte con risultati simili.
Per la verifica biochimica del sito di etichettatura, PRDX3 e PRDX1 identificati mediante spettrometria di massa sono stati modificati da istidina ad alanina e confrontati con il tipo selvaggio nei saggi di trasfezione.I risultati del PDPL hanno mostrato che la mutazione riduceva significativamente l'etichettatura (Fig. 2d).Nel frattempo, le sequenze peptidiche identificate nella ricerca aperta sono state sintetizzate e fatte reagire in vitro con miniSOG purificato in presenza della sonda 3 e della luce blu, producendo prodotti con uno spostamento di massa di +247 e +229 Da quando rilevati da LC-MS (Fig. .2e).).Per verificare se le proteine ​​prossimali interagenti potrebbero essere etichettate in vitro in risposta alla fotoattivazione di miniSOG, abbiamo progettato un test di prossimità artificiale mediante l'interazione tra la proteina miniSOG-6xHis e un anticorpo monoclonale anti-His in vitro (Figura 2f).In questo test, ci aspettavamo l'etichettatura prossimale delle catene pesanti e leggere di anticorpi con miniSOG.Infatti, le Western blot anti-topo (riconoscendo le catene pesanti e leggere dell'anticorpo marcato con anti-6xHis) e streptavidina hanno mostrato una forte biotinilazione delle catene pesanti e leggere.In particolare, abbiamo notato l'autobiotinilazione del miniSOG a causa del tag 6xHis e dei legami incrociati tra catene leggere e pesanti, che possono essere correlati al divario precedentemente descritto tra lisina e risposta prossimale 2-oxo-istidina.In conclusione, concludiamo che il PDPL modifica l'istidina in modo dipendente dalla prossimità.
Il nostro prossimo obiettivo era caratterizzare il proteoma subcellulare per testare la specificità dell'etichettatura in situ.Pertanto, abbiamo espresso stabilmente miniSOG nel nucleo, nella matrice mitocondriale o nella membrana ER esterna delle cellule HEK293T (Fig. 3a).L'analisi della fluorescenza del gel ha rivelato abbondanti bande etichettate in tre posizioni subcellulari e diversi modelli di etichettatura (Fig. 3b).L'analisi dell'imaging a fluorescenza ha mostrato un'elevata specificità del PDPL (Fig. 3c).Il flusso di lavoro PDPL è stato seguito da reazioni di clic con coloranti di rodamina per delineare i proteomi subcellulari utilizzando la microscopia a fluorescenza e i segnali PDPL sono stati colocalizzati con DAPI, tracker mitocondriali o tracker ER, a conferma dell'alta fedeltà di PDPL.Per le tre posizioni degli organelli, un confronto fianco a fianco di PDPL con TurboID utilizzando l'avidina western blot ha mostrato che PDPL era etichettato in modo più specifico rispetto ai rispettivi controlli.In condizioni PDPL, sono apparse più bande etichettate, indicando più proteine ​​​​etichettate con PDPL (Figura 6a-d supplementare).
una rappresentazione schematica dell'etichettatura del proteoma specifica dell'organello mediata da miniSOG.miniSOG prende di mira la matrice mitocondriale tramite la fusione con i 23 amminoacidi N-terminali della COX4 umana (mito-miniSOG), il nucleo tramite la fusione con H2B (nucleo-miniSOG) e Sec61β tramite il lato citoplasmatico della membrana ER (ER-miniSOG ).Le indicazioni includono gel imaging, imaging confocale e spettrometria di massa.b Immagini rappresentative del gel di tre profili PDPL specifici dell'organello.Blu brillante CBB Coomassie.c Immagini confocali rappresentative delle cellule HEK293T che esprimono stabilmente miniSOG con diverse localizzazioni subcellulari rilevate dall'anticorpo etichettato V5 (rosso).I marcatori subcellulari sono usati per i mitocondri e ER (verde).Il flusso di lavoro PDPL include il rilevamento di proteomi subcellulari etichettati con miniSOG (giallo) utilizzando la chimica del clic Cy3-azide.Barra della scala: 10 µm.d Grafici vulcanici di proteomi marcati con PDPL in vari organelli quantificati mediante quantificazione senza etichetta (n = 3 esperimenti biologici indipendenti).Il test t di Student a due code è stato utilizzato su trame vulcaniche.Il tipo selvaggio HEK293T è stato utilizzato come controllo negativo. Le proteine ​​significativamente modificate sono evidenziate in rosso (p <0,05 e >2 volte la differenza di intensità ionica). Le proteine ​​significativamente modificate sono evidenziate in rosso (p <0,05 e >2 volte la differenza di intensità ionica). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 e >2-кратная разница в интенсивности ионов). Le proteine ​​significativamente alterate sono evidenziate in rosso (p <0,05 e >2 volte la differenza nell'intensità ionica).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 e > 2-кратная разница в ионной силе). Le proteine ​​significativamente alterate sono evidenziate in rosso (p < 0,05 e > 2 volte la differenza nella forza ionica).Le proteine ​​correlate importanti per HEK293T-miniSOG ma non importanti per HEK293T sono mostrate in verde.e Analisi della specificità dei dataset proteomici da esperimenti d.Il numero totale di proteine ​​statisticamente significative in ciascun organello (punti rossi e verdi) è segnato in alto.Gli istogrammi mostrano proteine ​​localizzate negli organelli sulla base di MitoCarta 3.0, analisi GO e A. Ting et al.le persone.Set di dati separati per mitocondri, nuclei e ER.Questi esperimenti sono stati ripetuti indipendentemente almeno due volte con risultati simili.I dati grezzi sono forniti sotto forma di file di dati grezzi.
Incoraggiata dai risultati del gel e dell'imaging, la quantificazione senza etichetta è stata utilizzata per quantificare il proteoma identificato in ciascun organello (dati supplementari 2).HEK293T non trasfettato è stato utilizzato come controllo negativo per sottrarre i marcatori di fondo. L'analisi del grafico del vulcano ha mostrato proteine ​​​​significativamente arricchite (p <0, 05 e> intensità ionica> 2 volte) nonché proteine ​​​​singleton che sono presenti solo nelle linee che esprimono miniSOG (Fig. 3d punti rossi e verdi). L'analisi del grafico del vulcano ha mostrato proteine ​​​​significativamente arricchite (p <0, 05 e> intensità ionica> 2 volte) nonché proteine ​​​​singleton che sono presenti solo nelle linee che esprimono miniSOG (Fig. 3d punti rossi e verdi). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). L'analisi del grafico del vulcano ha mostrato proteine ​​​​significativamente arricchite (p <0, 05 e> intensità ionica> 2 volte) nonché singole proteine ​​​​che sono presenti solo nelle linee che esprimono miniSOG (Fig. 3d, punti rossi e verdi).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （P <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 以及 仅 存 在于 Minisog 表达 系 中 的 单一 蛋白质 （图 3D 红色 和 绿色点））。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （P <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 Minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3D 红色 绿色点 。。。））））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). L'analisi del grafico del vulcano ha rivelato proteine ​​​​significativamente arricchite (p <0, 05 e> 2x forza ionica) nonché singole proteine ​​​​presenti solo nella linea di espressione miniSOG (punti rossi e verdi in Fig. 3d).Combinando questi dati, abbiamo identificato rispettivamente 1364, 461 e 911 proteine ​​della membrana esterna nucleare, mitocondriale e ER statisticamente significative.Per analizzare l'accuratezza del PDPL localizzato in organelli, abbiamo utilizzato MitoCarta 3.0, analisi Gene Ontology (GO) e A. Ting et al.un set di dati8 è stato utilizzato per mitocondri, nucleo ed ER per testare la specificità degli organelli delle proteine ​​rilevate, corrispondente a un'accuratezza di 73,4, 78,5 e 73,0% (Fig. 3e).La specificità del PDPL conferma che il PDPL è uno strumento ideale per identificare i proteomi specifici degli organelli.In particolare, l'analisi subocondriale delle proteine ​​mitocondriali identificate ha mostrato che il proteoma intrappolato era distribuito principalmente nella matrice e nella membrana interna (226 e 106, rispettivamente), rappresentando il 91,7% (362) del numero totale di proteine ​​​​mitocondriali identificate.è stato inoltre confermato un livello elevato di PDPL (Figura 7a supplementare).Allo stesso modo, l'analisi subnucleare ha mostrato che il proteoma catturato era distribuito principalmente nel nucleo, nel nucleoplasma e nel nucleolo (Figura 7b supplementare).L'analisi proteomica nucleare con un peptide segnale di localizzazione nucleare (3xNLS) ha mostrato un'accuratezza simile al costrutto H2B (Figura 7c-h supplementare).Per determinare la specificità del marcatore PDPL, la laminina nucleare A è stata scelta come trappola POI7 localizzata in modo più discreto.PDPL ha identificato 36 proteine ​​significativamente arricchite, di cui 12 proteine ​​(30,0% inclusa la lamina A) erano proteine ​​​​di interazione della lamina A ben caratterizzate annotate dal database String, con una percentuale maggiore rispetto al metodo BioID (122 proteine) 28 su 28. , 22,9 %) 7. Il nostro metodo ha identificato un minor numero di proteine, probabilmente a causa di aree di etichettatura limitate, rese possibili dall'ossigeno singoletto più attivo.L'analisi GO ha mostrato che le proteine ​​identificate erano localizzate principalmente nel nucleoplasma (26), nella membrana nucleare (10), nella membrana nucleare (9) e nei pori nucleari (5).Collettivamente, queste proteine ​​​​localizzate nel nucleare rappresentavano l'80% delle proteine ​​​​arricchite, dimostrando ulteriormente la specificità del PDPL (Figura 8a-d supplementare).
Avendo stabilito la capacità del PDPL di eseguire la marcatura di prossimità negli organelli, abbiamo quindi testato se il PDPL potesse essere utilizzato per analizzare i partner di legame dei POI.In particolare, abbiamo cercato di definire l'analisi PDPL delle proteine ​​citosoliche, che sono considerate bersagli più difficili rispetto alle loro controparti localizzate sulla membrana a causa della loro natura altamente dinamica.La proteina BRD4 del bromodominio ed extraterminale (BET) ha attirato la nostra attenzione per il suo ruolo chiave in varie malattie 35, 36.Il complesso formato da BRD4 è un coattivatore trascrizionale e un importante bersaglio terapeutico.Regolando l'espressione dei fattori di trascrizione c-myc e Wnt5a, si ritiene che BRD4 sia un determinante chiave della leucemia mieloide acuta (LMA), del mieloma multiplo, del linfoma di Burkitt, del cancro del colon e delle malattie infiammatorie37,38.Inoltre, alcuni virus prendono di mira BRD4 per regolare la trascrizione virale e cellulare, come papillomavirus, HIV e SARS-CoV-236,39.
Per mappare l'interazione BRD4 utilizzando PDPL, abbiamo combinato miniSOG con una breve isoforma N o C-terminale di BRD4.I risultati proteomici hanno rivelato un alto grado di sovrapposizione tra i due costrutti (Figura 9a supplementare).Il proteoma nucleare identificato con miniSOG-H2B copre il 77,6% delle proteine ​​​​che interagiscono con BRD4 (Figura 9b supplementare).Quindi, sono stati utilizzati diversi tempi di illuminazione (2, 5, 10, 20 min) per regolare il raggio del marker (Fig. 4a e dati supplementari 3).Concludiamo che a fotoperiodi più brevi, PDPL etichetterà principalmente i partner di legame diretto, mentre periodi più lunghi includeranno proteine ​​identificate durante periodi di fotoattivazione più brevi e bersagli indiretti nei complessi di etichettatura.In effetti, abbiamo riscontrato una forte sovrapposizione tra punti temporali adiacenti (84,6% per 2 e 5 minuti; 87,7% per 5 e 10 minuti; 98,7% per 10 e 20 minuti) (Fig. 4b e Fig. 9c supplementare).In tutti i gruppi sperimentali, abbiamo trovato non solo l'autoetichettatura BRD4, ma diversi bersagli noti come MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A e HMGB1 annotati nel database delle stringhe.La forza ionica di questi bersagli è proporzionale al tempo di esposizione (Fig. 4c e Fig. 9d supplementare).L'analisi GO delle proteine ​​​​identificate nel gruppo di 2 minuti ha mostrato che le proteine ​​​​identificate erano localizzate nel nucleo e erano coinvolte nel rimodellamento della cromatina e nella funzione dell'RNA polimerasi.La funzione molecolare della proteina è stata arricchita nel legame della cromatina o nella coattiva trascrizionale, coerente con la funzione BRD4 (Fig. 4d).L'analisi dell'interazione proteica abilitata per database di stringhe ha rivelato un primo livello di interazioni indirette tra BRD4 e complessi interagenti della famiglia HDAC come SIN3A, NCOR2, BCOR e SAP130 (Fig. 4e e Fig. 9e supplementare), coerenti con BRD4 e HDAC che legano gli istoni acetilati ..Inoltre, i target rappresentativi identificati da LC-MS/MS, inclusi Sin3A, NSUN2, Fus e SFPQ, sono stati confermati dal Western blotting (Fig. 4f).Recentemente, è stato segnalato che l'isoforma corta di BRD4 forma nuclei con proprietà di separazione di fase liquido-liquido (LLPS).Le proteine ​​​​leganti l'RNA Fus e SFPQ mediano l'LLPS di vari processi cellulari e sono state identificate qui come proteine ​​​​leganti BRD4 non registrate.L'interazione tra BRD4 e SFPQ è stata confermata da esperimenti di co-immunoprecipitazione (co-IP) (Figura 4g), suggerendo un altro meccanismo per la separazione di fase liquido-liquido mediata da BRD4 che merita ulteriori indagini.Presi insieme, questi risultati suggeriscono che PDPL è una piattaforma ideale per identificare le proteine ​​​​di interazione BRD4 note e sconosciute.
a Rappresentazione schematica della marcatura di prossimità BRD4 mediata da miniSOG, tempi di esposizione: 2, 5, 10 e 20 min.b Sovrapposizione di proteine ​​identificate in tempi di illuminazione differenti.L'arricchimento proteico identificato in HEK293T-miniSOG-BRD4 era statisticamente significativo rispetto a HEK293T wild-type.c Intensità ionica durante la quantificazione delle proteine ​​​​leganti BRD4 note rappresentative non etichettate durante il tempo di esposizione specificato.n = 3 campioni biologicamente indipendenti.I dati sono presentati come media ± deviazione standard.d Analisi ontologica genica (GO) delle proteine ​​identificate nel gruppo di 2 minuti.Vengono elencati i primi dieci termini GO.Le bolle sono colorate in base alla categoria dei termini GO e la dimensione delle bolle è proporzionale al numero di proteine ​​​​trovate in ciascun termine.e Analisi di stringhe di proteine ​​che interagiscono con BRD4.I cerchi gialli sono colla diretta e i cerchi grigi sono il primo strato di colla indiretta.Le linee rosse rappresentano le interazioni determinate sperimentalmente e le linee blu rappresentano le interazioni previste.f Gli obiettivi di legame BRD4 rappresentativi identificati in LC-MS/MS sono stati verificati mediante Western blotting.g Gli esperimenti di co-immunoprecipitazione confermano l'interazione tra SFPQ e BRD4.Questi esperimenti sono stati ripetuti indipendentemente almeno due volte con risultati simili.I dati grezzi sono forniti sotto forma di file di dati grezzi.
Oltre a identificare bersagli associati a POI non registrati, ipotizziamo che PDPL sarà adatto per identificare substrati per enzimi, che richiederebbero la caratterizzazione di proteine ​​​​di legame indiretto in grandi complessi per annotare substrati non registrati.La parkina (codificata da PARK2) è una ligasi E3 ed è noto che le mutazioni della parkina causano il morbo di Parkinson giovanile autosomico recessivo (AR-JP)42.Inoltre, la parkina è stata descritta come essenziale per la mitofagia (autofagia mitocondriale) e la rimozione delle specie reattive dell'ossigeno.Tuttavia, sebbene siano stati identificati diversi substrati della parkina, il ruolo della parkina in questa malattia rimane poco chiaro.Per annotare i suoi substrati non caratterizzati, PDPL è stato testato aggiungendo miniSOG al terminale N o C di parkin.Le cellule sono state trattate con il trasportatore di protoni di cianuro di carbonile m-clorofenilidrazone (CCCP) per attivare la parkina attraverso la via PINK1-Parkin.Rispetto ai nostri risultati BRD4 PDPL, la fusione N-terminale parkin ha rivelato un insieme più ampio di proteine ​​​​bersaglio, sebbene coprisse una porzione più ampia del C-terminale (177 su 210) (Figura 5a, b e Dati supplementari 4).il risultato è coerente con i rapporti secondo cui i tag N-terminal possono attivare in modo anomalo Parkin44.Sorprendentemente, c'erano solo 18 proteine ​​sovrapposte nei nostri dati con risultati AP-MS pubblicati per Parkin43, probabilmente a causa delle differenze tra le linee cellulari e i flussi di lavoro della proteomica.Oltre a quattro proteine ​​note (ARDM1, HSPA8, PSMD14 e PSMC3) identificate con due metodi (Fig. 5c)43.Per convalidare ulteriormente i risultati di LC-MS/MS, il trattamento con PDPL e il successivo Western blotting sono stati utilizzati per confrontare i risultati del test delle cellule madri HEK293T e della linea di parkina N-terminale stabile.Gli obiettivi precedentemente sconosciuti CDK2, DUT, CTBP1 e PSMC4 sono stati testati con un legante noto, DNAJB1 (Fig. 5d).
Grafico del vulcano delle proteine ​​​​che interagiscono con la parkina nelle cellule HEK293T con miniSOG stabilmente espresso fuso al terminale N o C della parkina (n = 3 esperimenti biologici indipendenti).Il test t di Student a due code è stato utilizzato su trame vulcaniche.HEK293T è stato utilizzato come controllo negativo. Le proteine ​​significativamente modificate sono evidenziate in rosso (p <0,05 e >2 volte la differenza di intensità ionica). Le proteine ​​significativamente modificate sono evidenziate in rosso (p <0,05 e >2 volte la differenza di intensità ionica). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 e >2-кратная разница в интенсивности ионов). Le proteine ​​significativamente alterate sono evidenziate in rosso (p <0,05 e >2 volte la differenza nell'intensità ionica).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 e > 2-кратная разница в ионной силе). Le proteine ​​significativamente alterate sono evidenziate in rosso (p < 0,05 e > 2 volte la differenza nella forza ionica).Le proteine ​​correlate importanti per HEK293T-miniSOG ma non importanti per HEK293T sono mostrate in verde.b Diagramma di Venn che mostra le proteine ​​sovrapposte tra i costrutti N-terminale e C-terminale.I tag N-terminali possono attivare in modo anomalo la parkina e produrre proteine ​​​​più riconoscibili.c Diagramma di Venn che mostra le proteine ​​sovrapposte tra PDPL e AP-MS.Sono elencati gli interattori noti, tra cui 4 delle 18 proteine ​​sovrapposte e 11 delle 159 proteine ​​specificamente identificate nel PDPL.d Gli obiettivi rappresentativi identificati da LC-MS/MS sono stati verificati mediante Western blotting.e Ssu72 e SNW1 sono stati identificati come substrati di parkina non registrati.Questi plasmidi proteici contrassegnati da FLAG sono stati trasfettati in HEK293T e HEK293T-Parkin-miniSOG seguiti da trattamento CCCP in vari punti temporali.Il degrado era più pronunciato nella linea di sovraespressione di Parkin.f Utilizzando l'inibitore del proteasoma MG132, è stato confermato che il processo di degradazione di Ssu72 e SNW1 è mediato dall'ubiquitinazione del proteasoma.Questi esperimenti sono stati ripetuti indipendentemente almeno due volte con risultati simili.I dati grezzi sono forniti sotto forma di file di dati grezzi.
In particolare, le proteine ​​identificate da PDPL devono includere proteine ​​che legano la parkina e i loro substrati.Per rilevare substrati di parkina non registrati, abbiamo selezionato sette proteine ​​​​identificate (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 e SNW1) e plasmidi trasfettati per esporre questi geni a HEK293T normale ed esprimere stabilmente HEK293T di miniSOG-Parkin seguito da trattamento CCCP.I livelli di proteine ​​Ssu72 e SNW1 sono stati significativamente ridotti nella linea stabile miniSOG-Parkin (Fig. 5e).Il trattamento con CCCP per 12 ore ha comportato la degradazione più significativa di entrambi i substrati.Per indagare se la degradazione di Ssu72 e SNW1 è regolata dall'ubiquitinazione del proteasoma, è stato aggiunto l'inibitore del proteasoma MG132 per inibire l'attività del proteasoma e infatti abbiamo scoperto che il loro processo di degradazione era inibito (Fig. 5f).Ulteriori bersagli non substrati sono stati confermati come interattori Parkin utilizzando il Western blotting (Figura 10 supplementare), che ha mostrato risultati coerenti con LC-MS/MS.In conclusione, l'integrazione del flusso di lavoro PDPL con la verifica della trasfezione della proteina bersaglio consente l'identificazione di substrati di ligasi E3 non registrati.
Abbiamo sviluppato una piattaforma comune di marcatura di prossimità che consente di identificare nello spazio e nel tempo i POI che interagiscono.La piattaforma si basa sulla proteina fotosensibilizzante miniSOG, che è solo circa 12 kDa, meno della metà delle dimensioni dell'enzima maturo APEX2 (27 kDa) e un terzo delle dimensioni del TurboID (35 kDa).La dimensione più piccola dovrebbe ampliare notevolmente la gamma di applicazioni per lo studio di interazioni di piccole proteine.È necessaria un'ulteriore esplorazione di ulteriori fotosensibilizzanti, sia proteine ​​​​codificate geneticamente che piccole molecole, per aumentare la resa quantistica dell'ossigeno singoletto ed espandere la sensibilità di questo approccio.Per l'attuale versione di miniSOG, è possibile ottenere un'elevata risoluzione temporale utilizzando l'illuminazione blu per attivare i marcatori di prossimità.Inoltre, un tempo di esposizione più lungo ha rilasciato una "nuvola" più ampia di ossigeno singoletto, con conseguente modifica dei residui di istidina più distali, maggiore raggio di etichettatura e capacità di mettere a punto la risoluzione spaziale PDPL.Abbiamo anche testato sette sonde chimiche per aumentare il rapporto segnale-sfondo e abbiamo esplorato il meccanismo molecolare alla base di questo approccio.Il flusso di lavoro TOP-ABPP combinato con una ricerca aperta imparziale ha confermato che le modifiche si sono verificate solo nelle istidine e non è stato osservato alcun microambiente coerente per l'aumento delle modifiche dell'istidina, ad eccezione di una moderata preferenza per le istidine nella regione dell'ansa.
Il PDPL è stato utilizzato anche per caratterizzare i proteomi subcellulari con specificità e copertura del proteoma almeno paragonabili ad altri metodi di etichettatura di prossimità e sonde chimiche specifiche per organelli.I marcatori di prossimità sono stati utilizzati con successo anche per caratterizzare i proteomi di superficie, lisosomiali e associati al secretoma46,47.Crediamo che PDPL sarà compatibile con questi organelli subcellulari.Inoltre, abbiamo sfidato il PDPL identificando bersagli per il legame con le proteine ​​citosoliche che sono più complessi delle proteine ​​legate alla membrana a causa delle loro proprietà dinamiche e del coinvolgimento in interazioni più temporali.Il PDPL è stato applicato a due proteine, il coattivatore trascrizionale BRD4 e la ligasi associata alla malattia E3 Parkin.Queste due proteine ​​sono state scelte non solo per le loro funzioni biologiche fondamentali, ma anche per la loro rilevanza clinica e potenziale terapeutico.Per questi due POI sono stati identificati partner di legame ben noti e target non registrati.In particolare, la proteina SFPQ associata alla separazione di fase è stata confermata da co-IP, che potrebbe indicare un nuovo meccanismo mediante il quale BRD4 (isoforma corta) regola LLPS.Allo stesso tempo, riteniamo che l'identificazione dei substrati Parkin sia uno scenario in cui è richiesta l'identificazione di adesivi indiretti.Abbiamo identificato due substrati di parkina non identificati e confermato la loro degradazione lungo il percorso dell'ubiquitinazione-proteasoma.Recentemente, è stata sviluppata una strategia di intrappolamento basata su meccanismi per rilevare i substrati dell'idrolasi intrappolandoli con enzimi.Sebbene questo sia un metodo molto potente, non è adatto per l'analisi di substrati coinvolti nella formazione di grandi complessi e richiede la formazione di legami covalenti tra l'enzima e il substrato.Ci aspettiamo che il PDPL possa essere esteso per studiare altri complessi proteici e famiglie di enzimi, come le famiglie deubiquitinasi e metalloproteasi.
Una nuova forma di miniSOG, chiamata SOPP3, è stata sviluppata con una migliore produzione di ossigeno singoletto.Abbiamo confrontato miniSOG con SOPP3 e abbiamo riscontrato prestazioni di marcatura migliorate, sebbene il rapporto segnale-rumore sia rimasto invariato (Figura 11 supplementare).Abbiamo ipotizzato che l'ottimizzazione di SOPP3 (ad esempio, attraverso l'evoluzione diretta) porterebbe a proteine ​​fotosensibilizzanti più efficienti che richiedono tempi di luce più brevi e quindi consentono di catturare processi cellulari più dinamici.In particolare, l'attuale versione di PDPL è limitata all'ambiente cellulare poiché richiede l'illuminazione della luce blu e non può penetrare nei tessuti profondi.Questa caratteristica ne preclude l'uso negli studi su modelli animali.Tuttavia, la combinazione di optogenetica con PDPL potrebbe fornire un'opportunità per la ricerca sugli animali, soprattutto nel cervello.Inoltre, anche altri fotosensibilizzatori a infrarossi ingegnerizzati rimuovono questa limitazione.Attualmente sono in corso ricerche in questo settore.
La linea cellulare HEK293T è stata ottenuta da ATCC (CRL-3216).La linea cellulare è risultata negativa per l'infezione da micoplasma ed è stata coltivata in DMEM (Thermo, # C11995500BT) integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS, Vistech, #SE100-B) e l'1% di penicillina/streptomicina (Hyclone, #SV30010).cresciuto.
3-amminofenilene (campione 3) e (4-etinilfenil)metanammina (campione 4) sono stati acquistati da Bidepharm.La propilammina (sonda 2) è stata acquistata da Energy-chemicals.N-(2-amminofenil)pent-4-inammide (sonda 1) è stato sintetizzato secondo i metodi pubblicati.
La tabella supplementare 1 elenca i costrutti genetici utilizzati in questo studio.Le sequenze miniSOG e KillerRed sono state clonate da un plasmide regalo di P. Zou (Università di Pechino).La sequenza di targeting della matrice mitocondriale è stata derivata dai 23 amminoacidi N-terminali di COX4 e clonata nei vettori indicati utilizzando un assieme Gibson (Beyotime, # D7010S).Per mirare alla membrana e al nucleo del reticolo endoplasmatico, DNA umano SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplificato mediante PCR da una libreria di cDNA di cellule HEK293T e DNA H2B (donato da D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) e clonato , come accennato in precedenza.Salvo diversa indicazione, altri geni proteici utilizzati per la trasfezione e la costruzione di linee cellulari stabili sono stati amplificati mediante PCR dalla libreria di cDNA delle cellule HEK293T.G3S (GGGS) e G4S (GGGGS) sono stati usati come linker tra la proteina dell'esca e miniSOG.Un tag epitopo V5 (GKPIPNPLGLDST) è stato aggiunto a questi costrutti di fusione.Per l'espressione nei mammiferi e per stabilire una linea cellulare stabile, il costrutto di fusione miniSOG è stato subclonato nel vettore lentivirale pLX304.Per l'espressione batterica, miniSOG è stato clonato nel vettore pET21a etichettato 6xHis al C-terminale.
Le cellule HEK293T sono state seminate a 2,0 x 105 cellule per pozzetto in piastre a sei pozzetti e trasfettate 24 ore dopo con plasmidi lentivirali ricombinanti (2,4 μg di pLX304) e plasmidi di confezionamento virale (1,5 μg di psPAX2 e 1,2 μg di pMD2.G) utilizzando Lipo8000 (Beyotime , #C0533), circa l'80% di fusione.Dopo la trasfezione durante la notte, il mezzo è stato cambiato e incubato per altre 24 ore.La raccolta del virus è stata effettuata dopo 24, 48 e 72 ore.Prima dell'infezione delle linee cellulari bersaglio, il mezzo virale è stato filtrato attraverso un filtro da 0,8 μm (Merck, #millex-GP) ed è stato aggiunto polibrene (Solarbio, #H8761) a una concentrazione di 8 μg/ml.Dopo 24 ore, le cellule sono state lasciate recuperare cambiando il mezzo.Le cellule sono state selezionate utilizzando 5 μg/ml di blasticidina (Solarbio, n. 3513-03-9) per i primi tre passaggi come selezione stringente inferiore.Quindi ha utilizzato 20 μg/ml come regime più rigoroso per i tre passaggi successivi.
Le cellule sono state seminate in camere da 12 pozzetti (Ibidi, n. 81201) a una densità di circa 20.000 cellule per pozzetto.Per migliorare l'adesione delle cellule HEK293T, aggiungere 50 g/ml di fibronectina (Corning, n. 356008) diluita in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, Sangon, n. B640435) a 37°C.Le camere sono state pretrattate per 1 ora e poi rimosse con PBS.Dopo 24 ore, le cellule sono state lavate una volta con PBS, incubate con la sonda 3 da 1 mM in una soluzione salina bilanciata di Hanks fresca (HBSS, Gibco, n. 14025092) per 1 ora a 37°C, quindi incubate con un LED blu (460 nm ).) sono stati irradiati per 10 minuti a temperatura ambiente.Successivamente, le cellule sono state lavate due volte con PBS e fissate con formaldeide al 4% in PBS (Sangon, #E672002) per 15 minuti a temperatura ambiente.La formaldeide in eccesso è stata rimossa dalle cellule fissate lavando tre volte con PBS.Le cellule sono state quindi permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,5% (Sangon, #A600198) in PBS e lavate 3 volte con PBS.Quindi rimuovere la camera e aggiungere a ciascun campione 25 µl di una miscela di reazione click contenente 50 µM di Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) e 0,5 mg/ml di ascorbato di sodio (Aladdin, n. S105024) e incubato per 30 minuti a temperatura ambiente.Dopo una reazione rapida, le cellule sono state lavate sei volte con PBS contenente lo 0,05% di Tween-20 (Sangon, # A600560) (PBST) e quindi bloccate con il 5% di BSA (Abcone, # B24726) in PBST per 30 minuti a temperatura ambiente.
Per l'immunocolorazione della colocalizzazione, le cellule sono state incubate con anticorpi primari secondo le condizioni indicate: mAb anti-V5 di topo (1:500, CST, #80076), mAb anti-Hsp60 di coniglio (1:1000), ABclonal, #A0564), anticorpo policlonale anti-calnexina di coniglio (1:500, Abcam, #ab22595) o anticorpo monoclonale anti-lamina A/C di coniglio (1:500; CST, #2032) a 4 °C durante la notte.Dopo il lavaggio 3 volte con PBST, le cellule sono state incubate con anticorpi secondari: anti-coniglio di capra Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) diluito 1:1000, anti-topo di capra Alexa Fluor 594 (CST, #8889) diluito 1:1000.diluizione Diluire a temperatura ambiente per 30 minuti.Le cellule sono state quindi lavate 3 volte con PBST e controcolorate con DAPI (Thermo, #D1306) in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.Dopo 3 lavaggi con PBS, le cellule sono state sigillate in glicerolo al 50% (Sangon, # A600232) in PBS per l'imaging.Le immagini immunofluorescenti sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale ZEISS LSM 900 Airyscan2 e il software ZNE 3.5.
Per l'imaging fluorescente dell'ossigeno singoletto, le cellule sono state lavate due volte con il tampone Hanks HEPES prima di aggiungere 100 nM Si-DMA nel tampone Hanks HEPES (DOJINDO, # MT05).Dopo l'esposizione alla luce, le cellule sono state incubate in un incubatore a CO2 a 37°C per 45 minuti.Le cellule sono state quindi lavate due volte con il tampone HEPES di Hanks e controcolorate con Hoechst nel tampone HEPES di Hanks per 10 minuti a temperatura ambiente e visualizzate utilizzando un microscopio confocale ZEISS LSM 900., #M36008) in tampone HBSS contenente calcio e magnesio.Dopo l'esposizione alla luce o alla doxorubicina (MCE, #HY-15142A), le cellule sono state incubate in un incubatore a CO2 a 37°C per 10 minuti, lavate due volte con tampone HBSS e incubate con Hoechst in tampone HBSS a temperatura ambiente.minuti.La doxorubicina è stata utilizzata come controllo sonda positivo in cui le cellule sono state trattate con 20 μM di doxorubicina in HBSS contenente l'1% di BSA per 30 minuti.Le immagini immunofluorescenti sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale Zeiss LSM 900.
Le cellule HEK293T che esprimono stabilmente mito-miniSOG sono state seminate a una densità di circa il 30% in piatti da 15 cm.Dopo 48 ore, quando è stata raggiunta una confluenza dell'80% circa, le cellule sono state lavate una volta con PBS, incubate con 1 mM Probe 3 in tampone HBSS fresco per 1 ora a 37°C e quindi illuminate con un LED blu per 10 minuti nella stanza temperatura..Successivamente, le cellule sono state lavate due volte con PBS, raschiate e risospese in tampone PBS ghiacciato contenente inibitori della proteasi privi di EDTA (MCE, #HY-K0011).Le cellule sono state lisate sonicando la punta per 1 minuto (1 secondo acceso e 1 secondo spento al 35% di ampiezza).La miscela risultante è stata centrifugata a 15.871 xg per 10 minuti a 4°C per rimuovere i detriti e la concentrazione del surnatante è stata regolata a 4 mg/mL utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​BCA (Beyotime, #P0009).Combinare 1 ml del lisato di cui sopra con 0,1 mM di biotina azide fotodegradabile (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA ligando (Aladdin, #T162437) e 1 mM CuSO4 incubatrice con fondo rotazione per 1 ora a temperatura ambiente.Dopo una reazione rapida, aggiungere la miscela alla soluzione premiscelata (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) in una fiala di vetro da 10 ml.I campioni sono stati miscelati e centrifugati a 4500 g per 10 minuti a temperatura ambiente.Le soluzioni inferiore e superiore sono state scartate, il precipitato è stato lavato due volte con 1 ml di metanolo e centrifugato a 15871×g per 5 minuti a 4°C.Aggiungere 1 ml di urea 8 M (Aladdin, n. U111902) in bicarbonato di ammonio 25 mM (ABC, Aladdin, n. A110539) per sciogliere il precipitato.I campioni sono stati ricostituiti con ditiotreitolo 10 mM (Sangon, #A100281 in 25 mM ABC) per 40 minuti a 55°C seguiti dall'aggiunta di iodoacetammide fresca 15 mM (Sangon, #A600539) a temperatura ambiente al buio.Alchilazione entro 30 minuti..Un ulteriore ditiotreitolo 5 mM è stato aggiunto per fermare la reazione.Preparare circa 100 microlitri di perline di agarosio NeutrAvidin (Thermo, # 29202) per ogni campione lavando 3 volte con 1 ml di PBS.La suddetta soluzione di proteoma è stata diluita con 5 ml di PBS e incubata con perline di agarosio NeutrAvidin prelavate per 4 ore a temperatura ambiente.Le perline sono state quindi lavate 3 volte con 5 ml di PBS contenente lo 0,2% di SDS (Sangon, #A600485), 3 volte con 5 ml di PBS contenente urea 1M e 3 volte con 5 ml di ddH2O.Le perline sono state quindi raccolte mediante centrifugazione e risospese in 200 μl di 25 mM ABC contenente 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, # C805228) e 20 ng/μl di tripsina (Promega, # V5280).Trypsinize durante la notte a 37°C con rotazione.La reazione è stata interrotta aggiungendo acido formico (Thermo, # A117-50) fino a quando il pH ha raggiunto 2-3.Le sfere sono state lavate 3 volte con 1 ml di PBS contenente lo 0,2% di SDS, 3 volte con 1 ml di PBS contenente 1 M di urea e poi 3 volte con 1 ml di acqua distillata.I peptidi modificati sono stati rilasciati mediante lisi leggera (365 nm) per 90 minuti utilizzando 200 μl di MeOH al 70%.Dopo centrifugazione, il surnatante è stato raccolto.Le perline sono state quindi lavate una volta con 100 μl di MeOH al 70% e i surnatanti sono stati riuniti.I campioni sono stati essiccati in un concentratore sottovuoto Speedvac e conservati a -20°C fino all'analisi.
Per identificare e quantificare i peptidi modificati con ossigeno singoletto, i campioni sono stati ridisciolti in acido formico allo 0,1% e 1 μg di peptidi sono stati analizzati utilizzando uno spettrometro di massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid dotato di una sorgente nano ESI di Tune e Xcalibur del software del fornitore 4.3.I campioni sono stati separati su una colonna capillare confezionata internamente da 75 µm × 15 cm con materiale C18 da 3 µm (ReproSil-pur, #r13.b9.) e collegati a un sistema UHPLC EASY-nLC 1200 (Thermo).I peptidi sono stati separati mediante cromatografia lineare a gradiente di 95 minuti dall'8% di solvente B al 50% di solvente B (A = 0,1% di acido formico in acqua, B = 0,1% di acido formico nell'80% di acetonitrile), quindi aumentati linearmente al 98% di B min in 6 min ad una portata di 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos raccoglie i dati alternativamente tra la scansione MS completa e la scansione MS2 a seconda dei dati.La tensione di sputtering è stata impostata a 2,1 kV e la temperatura del capillare di trasporto ionico era di 320°C.Gli spettri MS (350-2000 m/z) sono stati raccolti con una risoluzione di 120.000, AGC 4 × 105 e un tempo di input massimo di 150 ms.I 10 precursori a carica multipla più comuni in ciascuna scansione completa sono stati frammentati utilizzando HCD con un'energia di collisione normalizzata del 30%, una finestra di isolamento del quadrupolo di 1,6 m/z e un'impostazione di risoluzione di 30.000.Un target AGC per spettrometria di massa tandem utilizzando 5×104 e tempo di input massimo 150 ms.L'eccezione dinamica è impostata su 30 secondi. Gli ioni non assegnati o quelli con una carica di 1+ e >7+ sono stati rifiutati per SM/SM. Gli ioni non assegnati o quelli con una carica di 1+ e >7+ sono stati rifiutati per SM/SM. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ e >7+ были отклонены для МС/МС. Gli ioni non assegnati o gli ioni con una carica di 1+ e >7+ sono stati rifiutati per SM/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ e >7+ были отклонены для МС/МС. Ioni non specificati o ioni con cariche di 1+ e >7+ sono stati rifiutati per SM/MS.
I dati grezzi vengono elaborati utilizzando la piattaforma informatica FragPipe basata su MSFragger.I bias di massa e gli amminoacidi corrispondenti sono stati determinati utilizzando un algoritmo di ricerca aperto con una tolleranza di massa del precursore compresa tra -150 e 500 Da.I peptidi modificati sono stati quindi identificati utilizzando modifiche dell'istidina con guadagni di massa di +229,0964 e +247,1069 Da in PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Le cellule che esprimono stabilmente il gene miniSOG fuso sono state piastrate in piatti da 6 cm.Dopo aver raggiunto circa l'80% di confluenza, le cellule sono state lavate una volta con HBSS (Gibco, n. 14025092), quindi incubate con sonde chimiche in HBSS per 1 ora a 37°C e illuminate con luce blu.LED da 10W per 20 minuti a temperatura ambiente.Per determinare quale tipo di specie reattiva dell'ossigeno è coinvolta nel PDPL, vitamina C 0,5 mM (MCE, #HY-B0166), Trolox 5 mM (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM di mannitolo (Energy Chemical, n. 69-65-8), 100 μM di H2O2, 10 mM di NaN3 sono stati aggiunti alle cellule come integratori.Dopo il lavaggio con PBS freddo, le cellule sono state raschiate, raccolte in provette da centrifuga da 1,5 ml e sonicate con una punta per 1 minuto in 200 μl di PBS con 1x inibitore della proteasi senza EDTA (1 s e 1 s senza, ampiezza 35%).La miscela risultante è stata centrifugata a 15.871 × g per 10 minuti a 4 ° C e la concentrazione del surnatante è stata regolata a 1 mg/mL utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​BCA.Circa 50 pi del lisato di cui sopra sono stati incubati con rodamina azide 0,1 mM (Aladdin, n. T131368), TCEP 1 mM, ligando TBTA 0,1 mM e CuSO4 1 mM per 1 ora a temperatura ambiente con rotazione dal basso verso l'alto.Dopo la reazione click, la precipitazione con acetone è stata effettuata aggiungendo 250 μl di acetone prerefrigerato ai campioni, incubando a -20°C per 20 min e centrifugando a 6010×g per 10 min a 4°C.Raccogliere il pellet e far bollire in 50 ml di tampone di 1x Laemmli per 10 min a 95 gradi centigradi.I campioni sono stati quindi analizzati su gel lunghi SDS-PAGE e visualizzati utilizzando il sistema di imaging Bio-rad ChemiDoc MP Touch con il software Image Lab Touch.
L'espressione e la purificazione della proteina miniSOG-6xHis ricombinante sono state eseguite come descritto in precedenza.In breve, le cellule di E. coli BL21 (DE3) (TransGen, # CD701-02) sono state trasformate con pET21a-miniSOG-6xHis e l'espressione proteica è stata indotta con IPTG 0, 5 mM (Sangon, # A600168).Dopo la lisi cellulare, le proteine ​​sono state purificate utilizzando sfere di agarosio Ni-NTA (MCE, n. 70666), dializzate contro PBS e conservate a –80°C.
Per un test di prossimità dell'etichetta in vitro basato su anticorpi, mescolare 100 μM di miniSOG purificato, 1 mM di sonda 3 e 1 μg di anticorpo monoclonale di topo anti-etichetta (TransGen, # HT501-01) in PBS a un volume di reazione totale di 50 μl..La miscela di reazione è stata irradiata con luce LED blu per 0, 2, 5, 10 e 20 minuti a temperatura ambiente.La miscela è stata incubata con biotina-PEG3-azide 0,1 mM (Aladdin, #B122225), TCEP 1 mM, ligando TBTA 0,1 mM e CuSO4 1 mM per 1 ora a temperatura ambiente su un agitatore a movimento ascendente.Dopo una reazione rapida, aggiungere 4x tampone di Laemmli direttamente alla miscela e far bollire a 95°C per 10 min.I campioni sono stati analizzati su gel SDS-PAGE e analizzati mediante western blotting con streptavidina-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Un peptide sintetico contenente istidina con amidazione C-terminale (LHDALDAK-CONH2) è stato utilizzato per analizzare l'etichettatura in vitro a base di peptidi vicini.In questo test, 100 μM di miniSOG purificato, 10 mM di sonda 3 e 2 μg/ml di peptide sintetico sono stati miscelati in PBS in un volume di reazione totale di 50 μl.La miscela di reazione è stata irradiata con luce LED blu per 1 ora a temperatura ambiente.Un microlitro di campione è stato analizzato utilizzando un sistema LC-MS (Waters, spettrometro di massa SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight con software di analisi dello spettro MassLynx).
Le cellule HEK293T che esprimono stabilmente il gene di fusione miniSOG sono state seminate in piatti da 10 cm per linee con diversa localizzazione di organelli (Mito, ER, Nucleus) e piatti da 15 cm per le linee Parkin-miniSOG e BRD4-miniSOG.Al raggiungimento di circa il 90% di confluenza, le cellule sono state lavate una volta con HBSS, quindi incubate con la sonda 3 in HBSS per 1 ora a 37°C e illuminate con un LED blu da 10 W a temperatura ambiente.Per l'etichettatura senza contatto di Parkin, 10 µM di vettore di cianuro di carbonile protonico m-clorofenilidrazone CCCP (Solarbio, # C6700) con la sonda 3 in HBSS è stato aggiunto per 1 ora a 37°C.Le fasi di lisi cellulare, chimica del clic, riduzione e alchilazione erano le stesse descritte sopra, tranne per il fatto che sono stati aggiunti 2 mg di lisato e nella reazione di clic è stata utilizzata biotina PEG3 azide invece della biotina azide fotodegradabile.Dopo l'arricchimento, le sfere sono state lavate 3 volte con 5 ml di PBS contenente lo 0,2% di SDS, 3 volte con 5 ml di PBS contenente 1 M di urea e 3 volte con 5 ml di PBS.Successivamente, 2 µg di tripsina sono stati aggiunti a 300 µl 25 mM di ABC contenenti 1 M di urea per scindere la proteina durante la notte a 37°C.La reazione è stata interrotta aggiungendo acido formico fino a raggiungere un pH di 2-3.Dopo la tripsinizzazione su sfere, la soluzione peptidica è stata dissalata utilizzando una colonna SOLAµ HRP (Thermo, n. 60209-001) ed essiccata in un concentratore sottovuoto Speedvac.I peptidi sono stati ridisciolti in acido formico allo 0,1% e 500 ng di peptidi sono stati analizzati utilizzando uno spettrometro di massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid dotato della sorgente nano-ESI descritta sopra.I peptidi sono stati separati su precolonne RP-HPLC commerciali (75 μm x 2 cm) (Thermo, n. 164946) e colonne analitiche RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, n. 164941), entrambe riempite con 2 μm.gradiente da 8% a 35% ACN in 60 minuti, quindi aumentato linearmente al 98% B in 6 minuti a una portata di 300 Nl/min.Gli spettri MS (350-1500 m/z) sono stati raccolti con una risoluzione di 60.000, AGC 4 × 105 e un tempo di input massimo di 50 ms.Gli ioni selezionati sono stati frammentati in sequenza dall'HCD in cicli di 3 s con un'energia di collisione normalizzata del 30%, una finestra di isolamento del quadrupolo di 1,6 m/z e una risoluzione di 15000. Un target AGC dello spettrometro di massa tandem 5 × 104 e un tempo di iniezione massimo di 22 ms sono stati utilizzati.L'esclusione dinamica è impostata su 45 secondi. Gli ioni non assegnati o quelli con una carica di 1+ e >7+ sono stati rifiutati per SM/SM. Gli ioni non assegnati o quelli con una carica di 1+ e >7+ sono stati rifiutati per SM/SM. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ e >7+ были отклонены для МС/МС. Gli ioni non assegnati o gli ioni con una carica di 1+ e >7+ sono stati rifiutati per SM/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ e >7+ были отклонены для МС/МС. Ioni non specificati o ioni con cariche di 1+ e >7+ sono stati rifiutati per SM/MS.
Le fasi di preparazione del campione fino all'arricchimento delle sfere di NeutrAvidin erano le stesse dell'analisi LC-MS/MS sopra descritta.Circa 50 μg di lisato sono stati utilizzati come input per il controllo del carico e 2 mg di lisato sono stati utilizzati per le reazioni di clic.Dopo l'arricchimento e il lavaggio con neutravidina, le proteine ​​legate sono state eluite aggiungendo 50 μl di tampone di Laemmli alle sfere di resina di agarosio e facendo bollire a 95°C per 5 minuti.I campioni di input del carico di controllo e arricchiti con sferette sono stati analizzati mediante SDS-PAGE e trasferiti su membrane PVDF (Millipore, #ISEQ00010) con metodi Western blot standard.Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% (Sangon, #A600669) in TBS contenente 0,1% di tween-20 (TBST) e incubate in sequenza con anticorpi primari e secondari.Gli anticorpi primari sono stati diluiti 1:1000 in latte scremato al 5% in TBST e incubati per una notte a 4°C.Gli anticorpi secondari sono stati utilizzati in un rapporto di 1:5000 e incubati per 1 ora a temperatura ambiente.Le membrane sono state visualizzate mediante chemiluminescenza utilizzando il sistema di imaging Chemidoc MP.Tutte le scansioni non tagliate di macchie e gel nella figura sono presentate come dati grezzi.
Gli anticorpi primari utilizzati in questo studio includevano l'anticorpo monoclonale di coniglio anti-SFPQ (CST, n. 71992), l'anticorpo monoclonale di coniglio anti-FUS (CST, n. 67840), l'anticorpo policlonale di coniglio anti-NSUN2 (Proteintech, n. 20854-1- AP), anticorpo policlonale di coniglio anti-mSin3A (Abcam, #ab3479), anticorpo monoclonale di topo anti-tag (TransGen, #HT201-02), anticorpo monoclonale di topo anti-β-actina (TransGen, #HC201-01), anticorpo monoclonale di topo anti-β-actina (TransGen, #HC201-01), -anticorpo monoclonale CDK2 (ABclonal, #A0094), anticorpo monoclonale di coniglio contro CTBP1 (ABclonal, #A11600), anticorpo policlonale di coniglio contro DUT (ABclonal, #A2901), anticorpo policlonale di coniglio contro PSMC4 (ABclonal, #A2505), anticorpo di coniglio anti- Anticorpo policlonale DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Questi anticorpi sono stati utilizzati a una diluizione 1:1000 in latte scremato al 5% in TBST.Gli anticorpi secondari utilizzati in questo studio includevano IgG anti-coniglio (TransGen, #HS101-01), IgG anti-topo (TransGen, #HS201-01) a una diluizione 1:5000.
Per indagare ulteriormente se BRD4 interagisce con SFPQ, le cellule stabili HEK293T e BRD4-miniSOG che sovraesprimono HEK293T sono state placcate in piatti da 10 cm.Le cellule sono state lavate con PBS freddo e lisate in 1 ml di tampone di lisi Pierce IP (Thermo Fisher, n. 87787) con inibitore della proteasi privo di EDTA per 30 minuti a 4°C.Successivamente, i lisati sono stati raccolti in provette da centrifuga da 1,5 ml e centrifugati a 15.871 xg per 10 minuti a 4°C.Il supernatante è stato raccolto e incubato con 5 µg di anticorpo monoclonale murino marcato con anti-V5 (CST, #80076) per una notte a 4°C.Lavare circa 50 ml di perline magnetiche di proteine ​​A/G (MCE, #HY-K0202) due volte con PBS contenente lo 0,5% di Tween-20.Quindi i lisati cellulari sono stati incubati con sfere magnetiche per 4 ore a 4°C con rotazione dal basso verso l'alto.Quindi le sfere sono state lavate quattro volte con 1 ml di tampone PBST e fatte bollire a 95°C per 5 minuti.I campioni sono stati analizzati su gel SDS-PAGE e trasferiti su membrane PVDF utilizzando metodi Western blot standard.Le membrane sono state bloccate nel latte scremato al 5% in TBST e incubate in sequenza con anticorpi primari e secondari.Primary Antibody L'anticorpo monoclonale di coniglio anti-SFPQ (CST, n. 71992) è stato utilizzato in un rapporto di 1:1000 nel latte scremato al 5% in TBST e incubato per una notte a 4°C.Le IgG anti-coniglio sono state utilizzate in un rapporto di 1:5000 e incubate per 1 ora a temperatura ambiente.Le membrane sono state visualizzate mediante chemiluminescenza utilizzando il sistema di imaging Chemidoc MP.
Tutte le strutture utilizzate per l'analisi dell'area di superficie accessibile al solvente (SASA) sono state ottenute dalla Protein Data Bank (PDB)52 o dall'AlphaFold Protein Structure Database53.Il SASA assoluto è stato calcolato per ogni residuo utilizzando il programma FreeSASA.Per ottenere il SASA medio per ciascuna struttura sono stati utilizzati solo dati SASA completi e non ambigui per l'istidina etichettata e i suoi vicini.L'accessibilità relativa al solvente (RSA) per ciascuna istidina è stata calcolata dividendo il valore assoluto di SASA per la massima superficie residua possibile empirica disponibile per il solvente.Tutte le istidine sono state quindi classificate come nascoste se la RSA media era inferiore al 20%, altrimenti esposte56.
I file grezzi ottenuti in modalità DDA sono stati ricercati utilizzando Proteome Discoverer (v2.5) o MSfragger (Fragpipe v15.0) nel database di proteine ​​verificate SwissProt appropriato contenente contaminanti comuni.I peptidi richiedevano la tripsina completa con due siti di scissione mancanti, la metilazione del carbamoil come modifica fissa e l'ossidazione della metionina come modifica dinamica.Le tolleranze di peso del precursore e del frammento sono state impostate rispettivamente a 10 ppm e 0,02 Da (MS2 Orbitrap). I colpi contaminanti sono stati rimossi e le proteine ​​​​sono state filtrate per ottenere un tasso di false scoperte <1%. I colpi contaminanti sono stati rimossi e le proteine ​​​​sono state filtrate per ottenere un tasso di false scoperte <1%. Попадания загрязняющих веществ ыли удалены, а белки отфильтрованы, чтобы поочччч кэээ кэ. I colpi contaminanti sono stati rimossi e le proteine ​​​​filtrate per fornire un tasso di falsi rilevamenti <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 <1%. <1%. I colpi contaminanti sono stati rimossi e le proteine ​​​​filtrate per ottenere un tasso di falsi positivi <1%.Per l'analisi quantitativa senza l'uso di etichette, è stato utilizzato il contenuto proteico normalizzato di tre ripetizioni biologiche.L'analisi della localizzazione subcellulare delle proteine ​​è stata eseguita utilizzando l'analisi di Gene Ontology (GO) da DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 e database compilati e pubblicati dal gruppo Alice Ting.La mappa del vulcano è stata ottenuta da Perseus (v1.6.15.0). I cambiamenti della piega dell'abbondanza proteica sono stati testati per la significatività statistica utilizzando un test t a due code e i risultati proteici sono stati identificati con variazione dell'abbondanza > 2 (se non diversamente indicato) e valore p <0, 05. I cambiamenti della piega dell'abbondanza proteica sono stati testati per la significatività statistica utilizzando un test t a due code e i risultati proteici sono stati identificati con variazione dell'abbondanza > 2 (se non diversamente indicato) e valore p <0, 05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Le variazioni della piega del contenuto proteico sono state testate per la significatività statistica utilizzando un test t a due code e sono state identificate corrispondenze proteiche con variazione del contenuto >2 (se non diversamente specificato) e valore ap <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有 说明） 和 P 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 变化 变化> 2 （另 有 说明） 和 P 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Il significato statistico dei cambiamenti di piega nel contenuto proteico è stato testato utilizzando un t-test a due code e sono state determinate le corrispondenze proteiche per le modifiche del contenuto >2 (se non diversamente indicato) e p-valori <0,05.L'analisi dell'interazione proteica è stata eseguita utilizzando l'analisi GO insieme al database String.
Tre repliche biologiche sono state effettuate con risultati simili.L'analisi statistica è stata eseguita con GraphPad Prism (software GraphPad) e i grafici del vulcano sono stati generati con Perseus (v1.6.15.0).Per confrontare i due gruppi, i valori p sono stati determinati utilizzando il test t di Student a due code.Solo le proteine ​​singleton identificate almeno due volte nel gruppo sperimentale sono state incluse nei grafici del vulcano e i corrispondenti valori mancanti nel gruppo di controllo sono stati sostituiti con Perseus da una distribuzione normale in modo da poter calcolare il valore p.Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.Nelle analisi proteomiche per l'analisi statistica, è stata mantenuta l'abbondanza di proteine ​​che sono apparse in almeno due repliche biologiche.I metodi statistici non sono stati utilizzati per predeterminare la dimensione del campione.Gli esperimenti non sono casuali.I ricercatori non erano ciechi rispetto ai compiti durante l'esperimento e la valutazione dei risultati.
Per ulteriori informazioni sulla progettazione dello studio, vedere l'abstract del rapporto sulla ricerca sulla natura collegato a questo articolo.
I dati di spettrometria di massa ottenuti in questo studio sono stati inviati al ProteomeXchange Consortium tramite il repository partner iProX57 con ID set di dati PXD034811 (set di dati PDPL-MS).I dati grezzi sono forniti sotto forma di file di dati grezzi.Questo articolo fornisce i dati originali.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Conoscere il quartiere: utilizzare la biotinilazione dipendente dalla prossimità per caratterizzare i complessi proteici e mappare gli organelli. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Conoscere il quartiere: utilizzare la biotinilazione dipendente dalla prossimità per caratterizzare i complessi proteici e mappare gli organelli.Gingras, AS, Abe, KT e Raut, B. Familiarità con l'ambiente circostante: utilizzo della biotinilazione dipendente dalla prossimità per caratterizzare i complessi proteici e mappare gli organelli. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并绘制细胞器图。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Capire il vicinato: sfrutta la dipendenza del vicinato dalla vita biologica.Gingras, AS, Abe, KT e Raut, B. Comprensione della prossimità: caratterizzazione di complessi proteici e mappatura degli organelli mediante biotinilazione dipendente dalla prossimità.Attuale.La mia opinione.Chimico.biologia 48, 44–54 (2019).
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