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Le strategie diagnostiche tradizionali per rilevare le malattie infettive richiedono l'uso di strumenti da banco che non sono adatti per i test point-of-care (POCT).La microfluidica emergente è una tecnologia altamente miniaturizzata, automatizzata e integrata che rappresenta una potenziale alternativa ai metodi tradizionali per una diagnostica in loco rapida, a basso costo e accurata.I metodi diagnostici molecolari sono ampiamente utilizzati nei dispositivi microfluidici come i metodi più efficaci per il rilevamento dei patogeni.Questa recensione riassume i recenti progressi nella diagnostica molecolare delle malattie infettive basata sulla microfluidica da una prospettiva sia accademica che industriale.In primo luogo, descriviamo una tipica elaborazione su chip degli acidi nucleici, inclusi il pretrattamento del campione, l'amplificazione e la lettura del segnale.Vengono quindi confrontate le caratteristiche, i vantaggi e gli svantaggi dei quattro tipi di piattaforme microfluidiche.Successivamente, discuteremo l'uso di saggi digitali per la quantificazione assoluta degli acidi nucleici.Sia i classici che i recenti dispositivi diagnostici molecolari commerciali basati sulla microfluidica sono riassunti come prove dello stato attuale del mercato.Infine, proponiamo future direzioni per la diagnosi microfluidica delle malattie infettive.
Le malattie infettive sono causate da agenti patogeni, inclusi batteri, virus e parassiti, che sono distribuiti in tutto il mondo.A differenza di altre malattie, i patogeni si infettano rapidamente e si diffondono tra l'uomo e gli animali ospiti attraverso l'inoculazione, l'aria e i mezzi idrici [1].La prevenzione delle malattie infettive è fondamentale come misura di salute pubblica.Tre strategie principali per combattere le malattie infettive: (1) controllare la fonte dell'infezione;(2) interruzione del percorso di trasmissione;(3) protezione delle popolazioni suscettibili.Tra le strategie principali, il controllo della fonte di infezione è considerata la strategia più importante per la sua convenienza e il basso costo.La diagnosi rapida, l'isolamento e il trattamento degli individui infetti sono fondamentali e richiedono strategie diagnostiche rapide, sensibili e accurate [2].L'attuale diagnosi di malattie infettive di solito combina l'esame clinico basato su segni e sintomi e studi di laboratorio come la coltura cellulare e la diagnostica molecolare, che richiedono personale addestrato, procedure ad alta intensità di lavoro e costose apparecchiature di test [3, 4].La prevenzione delle epidemie di malattie infettive richiede una diagnosi locale rapida, poco costosa e accurata, specialmente nelle aree con risorse limitate dove le malattie infettive sono comuni e gravi [5], così come il trattamento nella natura selvaggia o sul campo di battaglia, dove le emergenze sono imprevedibili..le cure mediche sono limitate [6].In questo contesto, la microfluidica è una tecnologia che combina le tecnologie dei sistemi microelettromeccanici, la nanotecnologia o la scienza dei materiali per una manipolazione precisa dei fluidi [7,8,9,10], fornendo nuove possibilità per il rilevamento del punto di cura (POCT).) agenti infettivi al di fuori di ospedali e laboratori.Rispetto alla diagnostica tradizionale, che richiede tempo, la tecnologia microfluidica offre campioni e risparmi sui costi per la diagnostica molecolare durante l'insorgenza di malattie.La diffusione globale della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) è causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), quindi viene nuovamente sottolineata l'importanza della microfluidica per la prevenzione e il controllo tempestivi della pandemia [11, 12 , 13].A differenza della diagnostica tradizionale, il POCT microfluidico utilizza piccoli dispositivi portatili che vanno da analizzatori da banco a piccole strisce reattive sidestream per testare vicino al punto di campionamento [14].Questi test sono caratterizzati da una preparazione del campione semplicistica o assente, un'amplificazione rapida del segnale e letture del segnale sensibili con conseguente breve durata e risultati accurati in pochi minuti.La disponibilità e la produzione in serie di strumenti sanitari basati sulla microfluidica hanno ampliato le loro applicazioni diagnostiche economiche e dirette al di fuori dell'ospedale, vicino al paziente e persino a casa.
Tra le strategie esistenti per la diagnosi delle malattie infettive, la diagnostica molecolare è una delle più sensibili [15, 16].Inoltre, la diagnostica molecolare è spesso utilizzata come gold standard per il rilevamento continuo di COVID-19, consentendo il rilevamento diretto di regioni virus-specifiche di RNA o DNA prima dell'inizio di una risposta immunitaria [17, 18].Nella presente rassegna, presentiamo gli ultimi progressi nei processi diagnostici molecolari basati sulla microfluidica per le malattie infettive, da una prospettiva accademica alle future prospettive industriali (Fig. 1).Inizieremo con tre passaggi chiave nel rilevamento dell'acido nucleico: pretrattamento del campione su chip, amplificazione dell'acido nucleico e lettura del segnale.Abbiamo quindi confrontato diversi tipi di piattaforme microfluidiche con la loro struttura e funzione, mostrando caratteristiche uniche (punti di forza e di debolezza).Il rilevamento digitale dell'acido nucleico viene ulteriormente discusso e fornito come esempio di una tecnologia di terza generazione per la quantificazione assoluta delle molecole di agenti patogeni infettivi.Inoltre, verranno presentati diversi dispositivi POCT commerciali tipici e più recenti per dimostrare lo stato attuale del mercato POCT microfluidico per la diagnostica molecolare.Discuteremo e spiegheremo anche la nostra visione per applicazioni future.
I moduli di chip microfluidici per il rilevamento dell'acido nucleico possono essere suddivisi in tre categorie (campionamento, riconoscimento e segnalazione) in base alle loro funzioni [19].Tra questi moduli, il modulo di campionamento realizza principalmente la lisi del campione e l'estrazione dell'acido nucleico.Il modulo sensore controlla principalmente la conversione e l'amplificazione dei segnali di acido nucleico.Il modulo di segnalazione rileva il segnale convertito ed elaborato dal modulo di rilevamento.Sulla base del processo di rilevamento degli acidi nucleici su un chip, riassumeremo i vari chip che possono realizzare la funzione "input e output".
Il primo passo nel rilevamento dell'acido nucleico è l'estrazione dell'acido nucleico, cioè l'isolamento dell'acido nucleico bersaglio dal campione originale.L'estrazione degli acidi nucleici viene eseguita per purificare gli acidi nucleici da altri contaminanti molecolari, garantire l'integrità della struttura primaria delle molecole di acido nucleico e ottimizzare i risultati.L'estrazione dell'acido nucleico richiede la lisi del campione necessaria e la cattura dell'acido nucleico, la cui qualità ed efficienza hanno un enorme impatto sui risultati della ricerca e della diagnostica.Eventuali lievi effetti collaterali durante l'estrazione possono limitare ulteriori rilevamenti.Ad esempio, i metodi di reazione a catena della polimerasi (PCR) e di amplificazione isotermica ad anello (LAMP) sono inibiti da alcuni solventi organici residui come etanolo e isopropanolo nei reagenti di isolamento degli acidi nucleici [20].L'estrazione liquido-liquido e l'estrazione in fase solida sono i metodi più popolari per isolare gli acidi nucleici [21], tuttavia, l'estrazione liquido-liquido su un chip è estremamente limitata, poiché i reagenti utilizzati nell'estrazione liquido-liquido causano la corrosione della maggior parte dei chip microfluidici .Qui, evidenziamo i metodi di estrazione in fase solida basati su microarray e ne confrontiamo vantaggi e svantaggi.
Il silicio è un materiale di substrato compatibile con gli acidi nucleici grazie alla sua biocompatibilità, stabilità e facilità di modifica [22].È importante sottolineare che, se modificato con silice o altri materiali, questo composito mostra proprietà di adsorbire acidi nucleici caricati negativamente in condizioni di basso pH e sale elevate mentre eluisce con soluzioni a pH elevato e basso sale.Sulla base di questo fenomeno, è possibile purificare l'acido nucleico.
Varie forme di materiali a base di silice sono state utilizzate per l'estrazione di acido nucleico in microfluidica, come perle di silice, polveri, filtri in microfibra e membrane di silice [23, 24, 25, 26].A seconda delle proprietà del materiale, i materiali a base di silicio possono essere utilizzati nei microcircuiti in modi diversi.Ad esempio, granuli di silice, polveri e nanofiltri commerciali possono essere semplicemente inseriti nei pori o nei microcanali dei chip microfluidici e aiutare a estrarre gli acidi nucleici dai campioni [27, 28, 29].Le membrane di silice modificata in superficie possono anche essere utilizzate per purificare rapidamente il DNA dai patogeni a basso costo.Ad esempio, Wang et al.[30] Combinando reazioni di amplificazione denaturante con scambio di catena mediato da vescicole con membrane di silice rivestite con oligosaccaridi chitosano, è stato introdotto un sistema portatile versatile che ha rilevato con successo 102-108 unità formanti colonie.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., e la presenza del virus era facilmente visibile.Powell et al.[31] Sono stati quindi utilizzati microarray a base di silicio per rilevare il virus dell'epatite C (HCV), il virus dell'immunodeficienza umana (HIV), il virus Zika e il papillomavirus umano e la propagazione automatica, in cui è stato sviluppato un microreattore tortuoso da 1,3 μl per catturare i virus a RNA.ed eseguire l'amplificazione in situ.Oltre a questi metodi, anche le microcolonne di silice modificate in superficie svolgono un ruolo chiave nell'estrazione dell'acido nucleico, poiché la geometria e le proprietà del materiale modificante aumentano notevolmente l'efficienza di estrazione.Chen et al.[32] hanno proposto una piattaforma microfluidica per l'isolamento di RNA a bassa concentrazione basata su microcolonne di silicio rivestite di amminoacidi.Questo dispositivo microfluidico integra una matrice di micropilastri da 0,25 cm2 su un substrato di silicio per ottenere una maggiore efficienza di estrazione attraverso un design ad alto rapporto superficie/volume.Il vantaggio di questo design è che il dispositivo microfluidico può raggiungere un'efficienza di estrazione dell'acido nucleico fino al 95%.Queste strategie a base di silicio dimostrano il valore di isolare rapidamente gli acidi nucleici a basso costo.In combinazione con i chip microfluidici, le strategie di estrazione a base di silicio possono non solo aumentare l'efficienza del rilevamento dell'acido nucleico, ma anche facilitare la miniaturizzazione e l'integrazione dei dispositivi analitici [20].
I metodi di separazione magnetica utilizzano particelle magnetiche per isolare gli acidi nucleici in presenza di un campo magnetico esterno.Le particelle magnetiche comunemente utilizzate includono particelle magnetiche Fe3O4 o γ-Fe2O3 rivestite con silice, ammino e carbossile [33,34,35,36].La caratteristica distintiva delle particelle magnetiche rispetto ai metodi SPE a base di silicio è la facilità di manipolazione e controllo con magneti esterni.
Utilizzando l'interazione elettrostatica tra acidi nucleici e silice, in condizioni di alto sale e basso pH, gli acidi nucleici vengono adsorbiti sulla superficie delle particelle magnetiche rivestite di silice, mentre in condizioni di basso sale e alto pH, le molecole possono essere lavate ancora..Le sfere magnetiche rivestite di silice consentono di estrarre il DNA da campioni di grande volume (400 μL) utilizzando il movimento controllato magneticamente [37].A titolo di dimostrazione, Rodriguez-Mateos et al.[38] hanno utilizzato magneti sintonizzabili per controllare il trasferimento di sfere magnetiche a diverse camere.Sulla base di particelle magnetiche rivestite di silice, è possibile estrarre 470 copie/mL di RNA genomico SARS-CoV-2 da campioni di acque reflue per il rilevamento della trascrizione inversa LAMP (RT-LAMP) e la risposta può essere letta entro 1 ora.occhio nudo (Fig. 2a).
Dispositivi basati su materiali magnetici e porosi.Diagramma concettuale del dispositivo microfluidico IFAST RT-LAMP per il rilevamento dell'RNA SARS-CoV-2 (adattato da [38]).b Microdispositivo centrifugo per dSPE dell'acido nucleico del tampone buccale (adattato da [39]).c Concentratore di campioni autoalimentato incorporato che utilizza una scheda FTA® (adattato da [50]).d Carta da filtro Fusion 5 modificata con chitosano (adattato da [51]).SARS-CoV-2 sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2, amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa RT-LAMP, partner tecnologici di ricerca FTA, acido nucleico NA
Le particelle magnetiche caricate positivamente sono ideali per attaccare la spina dorsale di fosfato di un acido nucleico.Ad una certa concentrazione di sale, i gruppi fosfato caricati negativamente degli acidi nucleici possono essere caricati positivamente sulla superficie delle particelle magnetiche composite.Pertanto, sono state sviluppate nanoparticelle magnetiche con una superficie ruvida e un'alta densità di gruppi amminici per l'estrazione di acidi nucleici.Dopo la separazione e il blocco magnetici, le nanoparticelle magnetiche e i complessi di DNA possono essere utilizzati direttamente nella PCR, eliminando la necessità di operazioni di purificazione ed eluizione complesse e dispendiose in termini di tempo [35].Le nanoparticelle magnetiche rivestite con gruppi carbossilici negativi sono state utilizzate anche per separare gli acidi nucleici adsorbiti sulle superfici in soluzioni di polietilenglicole e cloruro di sodio ad alta concentrazione [36].Con queste sfere magnetiche modificate in superficie, l'estrazione del DNA è compatibile con la successiva amplificazione.Dignan et al.[39] hanno descritto una piattaforma microfluidica centrifuga automatizzata e portatile per il pretrattamento dell'acido nucleico, consentendo al personale non tecnico di utilizzarla in loco.Inoltre, la compatibilità del DNA isolato con LAMP, un metodo adatto per l'analisi dell'acido nucleico point-of-care, dimostra ulteriormente i requisiti minimi delle apparecchiature e l'idoneità per i test colorimetrici (Fig. 2b).
I metodi a microsfere magnetiche offrono la possibilità di estrazione automatizzata, alcuni dei quali esistono negli estrattori automatici di acido nucleico commerciali [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (Pechino, Cina) e Biomek®;Beckman (Miami, USA).), Florida, USA)].I vantaggi della combinazione di sfere magnetiche con microfluidica possono essere utilizzati per un'efficiente estrazione automatizzata di acidi nucleici, che potrebbe potenzialmente far avanzare lo sviluppo della diagnostica molecolare;tuttavia, la combinazione di sfere magnetiche con microfluidica si basa ancora molto su sistemi di controllo complessi per la manipolazione precisa delle sfere magnetiche, il che spiega la popolarità dei prodotti commerciali che sono ingombranti e costosi, il che limita l'ulteriore applicazione delle sfere magnetiche in POCT.
Diversi materiali porosi come filtri di nitrocellulosa modificati, carte Finders Technology Associates (FTA), carte da filtro a base di polietersulfone e materiali rivestiti di glicano sono stati utilizzati anche per il rilevamento dell'acido nucleico [40, 41, 42, 43, 44].I materiali fibrosi porosi come la carta fibrosa sono stati utilizzati per la prima volta per isolare il DNA aggrovigliando fisicamente le molecole di DNA a filamento lungo con le fibre.I piccoli pori portano a una forte restrizione fisica delle molecole di DNA, che influisce positivamente sull'estrazione del DNA.A causa delle diverse dimensioni dei pori della carta fibrosa, l'efficienza dell'estrazione non può soddisfare le esigenze di amplificazione del DNA [45, 46].La carta FTA è una carta da filtro commerciale utilizzata nel campo della medicina legale e ampiamente utilizzata in altri settori della diagnostica molecolare.Attraverso l'uso di carta da filtro di cellulosa impregnata con varie sostanze chimiche per lisare le membrane cellulari nel campione, il DNA rilasciato è protetto dalla degradazione per un massimo di 2 anni.Più recentemente, è stata sviluppata carta di cellulosa impregnata per il rilevamento molecolare di vari agenti patogeni, tra cui SARS-CoV-2, leishmaniosi e malaria [47,48,49].L'HIV nel plasma isolato viene lisato direttamente e l'acido nucleico virale viene arricchito nella membrana di flusso FTA® incorporata nel concentratore, che consente una produzione efficiente dell'acido nucleico [50] (Fig. 2c).Il problema principale con il rilevamento dell'acido nucleico utilizzando le schede FTA è che sostanze chimiche come la guanidina e l'isopropanolo inibiscono le successive reazioni di amplificazione.Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato la carta da filtro modificata con chitosano Fusion 5, che combina i vantaggi sia dell'interlacciamento fisico delle molecole di DNA e della carta da filtro fibrosa, sia dell'adsorbimento elettrostatico del DNA su composti modificati con chitosano per ottenere un'estrazione dell'acido nucleico altamente efficiente ..fibre filtranti [51] (Fig. 2d).Allo stesso modo, Zhu et al.[52] hanno dimostrato un metodo PCR modificato con chitosano basato su un sistema microfluidico capillare in situ per un rapido isolamento e rilevamento dell'RNA del virus Zika.Gli acidi nucleici possono essere adsorbiti/desorbiti in un mezzo misto lisato/PCR, rispettivamente, in base alla proprietà interruttore on/off del chitosano.acceso e spento”, sensibile al pH.
Come accennato in precedenza, queste strategie combinano i vantaggi di vari materiali in fase solida e aumentano l'efficienza dell'estrazione dell'acido nucleico nella microfluidica.Nelle applicazioni pratiche, l'uso di questi materiali in grandi quantità è antieconomico e anche un adeguato trattamento superficiale o la modifica della superficie dei materiali comuni con questi materiali può preservarne la funzione.Pertanto, si ritiene che l'attuazione di queste strategie dopo uno studio pilota possa ridurre i costi.
Il test degli acidi nucleici su piattaforme microfluidiche utilizza spesso piccoli volumi di campione (< 100 µl), pertanto richiede l'amplificazione degli acidi nucleici target con sonde specifiche per la conversione in un segnale conveniente per il rilevamento a valle (ottico, elettrico e magnetico) [53, 54]. Il test degli acidi nucleici su piattaforme microfluidiche utilizza spesso piccoli volumi di campione (< 100 µl), pertanto richiede l'amplificazione degli acidi nucleici target con sonde specifiche per la conversione in un segnale conveniente per il rilevamento a valle (ottico, elettrico e magnetico) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Quando si testano gli acidi nucleici su piattaforme microfluidiche, vengono spesso utilizzati piccoli volumi di campione (<100 µL), quindi è necessaria l'amplificazione degli acidi nucleici target con sonde speciali per convertirli in un segnale conveniente per il successivo rilevamento (ottico, elettrico e magnetico) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （<100 µl） ， 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 扩增 核酸 ， 以 以 转换 为 便于 下游 检测 （光学 电学 和 磁学）） 的 信号 [53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （（光学 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Il rilevamento di acidi nucleici su piattaforme microfluidiche utilizza solitamente piccoli volumi di campione (<100 μl), che richiedono l'amplificazione degli acidi nucleici target con sonde speciali per convertirli in segnali per il successivo rilevamento (ottico, elettrico e magnetico) [53, 54]] .L'amplificazione degli acidi nucleici nella microfluidica può anche accelerare le reazioni, ottimizzare i limiti di rilevamento, ridurre i requisiti di campione e migliorare l'accuratezza del rilevamento [55, 56].Negli ultimi anni, con la realizzazione di un rilevamento rapido e accurato, sono stati applicati vari metodi di amplificazione degli acidi nucleici nella microfluidica, tra cui la PCR e alcune reazioni di amplificazione isotermica.Questa sezione riassumerà i metodi per il rilevamento dell'acido nucleico basati su sistemi microfluidici.
La PCR è una simulazione del processo di replicazione del DNA di un organismo, la cui teoria è descritta in dettaglio altrove e non sarà discussa qui.La PCR può amplificare una quantità molto piccola di DNA/RNA bersaglio a una velocità esponenziale, rendendo la PCR un potente strumento per il rilevamento rapido degli acidi nucleici.Negli ultimi decenni, molti dispositivi microfluidici portatili dotati di sistemi di ciclo termico PCR sono stati sviluppati per soddisfare le esigenze della diagnostica point-of-care [57, 58].La PCR su chip può essere suddivisa in quattro tipi (convenzionale, a flusso continuo, a commutazione spaziale e convettiva) secondo diversi metodi di controllo della temperatura [59].Ad esempio, Gee et al.[60] hanno sviluppato un metodo di PCR quantitativa di trascrizione inversa diretta (RT-qPCR) sulla propria piattaforma microfluidica per il rilevamento multiplex di SARS-CoV-2, virus dell'influenza A e B in campioni di tampone faringeo (Fig. 3a).Parco et al.[61] hanno costruito un semplice chip per l'analisi dei patogeni integrando PCR a film sottile, elettrodi e un modulo microfluidico a base di polidimetilsilossano azionato con le dita.Tuttavia, entrambi i lavori incarnano le carenze comuni della PCR convenzionale.La PCR richiede il ciclo termico, che limita l'ulteriore miniaturizzazione del dispositivo e riduce i tempi di test.
Lo sviluppo della PCR microfluidica e a commutazione di spazio basata su flusso continuo è fondamentale per affrontare questo problema.Utilizzando un canale a serpentina lungo o un canale rettilineo corto, la PCR a flusso continuo può fornire un'amplificazione rapida facendo circolare attivamente i reagenti in tre zone di preriscaldamento con una pompa off-chip.Questa operazione evita con successo la fase di transizione tra diverse temperature di reazione e quindi riduce significativamente il tempo di test [62] (Fig. 3b).In un altro studio di Jung et al.[63] hanno proposto un nuovo analizzatore genetico per PCR rotante che combina le caratteristiche della PCR fissa e di flusso per la PCR a trascrizione inversa ultraveloce e multiplex (Fig. 3c).Per l'amplificazione dell'acido nucleico, il microchip PCR sarà ruotato attraverso tre blocchi riscaldanti a diverse temperature: 1. Blocco di denaturazione a 94°C, 2. Blocco di ricottura a 58°C, 3. Blocco di espansione a 72°C.
Applicazione della PCR in microfluidica.Rappresentazione schematica di dirRT-qPCR su una piattaforma microfluidica (adattato da [60]).b Rappresentazione schematica di un microarray PCR a flusso continuo basato su un canale a serpentina (adattato da [62]).c Rappresentazione schematica di un analizzatore genetico PCR rotativo, costituito da un microchip, tre blocchi riscaldanti e un motore passo-passo (adattato da [63]).d Diagramma della PCR a termoconvezione con centrifugazione e configurazione (adattato da [64]).DirRT-qPCR, reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa diretta
Utilizzando capillari e anse o anche piastre sottili, la PCR a convezione può amplificare rapidamente gli acidi nucleici mediante convezione termica libera naturale senza la necessità di una pompa esterna.Ad esempio, una piattaforma microfluidica polimerica olefinica ciclica è stata sviluppata su uno stadio di riscaldamento rotante fabbricato che utilizza il ciclo termico con centrifugazione in un microcanale ad anello PCR [64] (Fig. 3d).La soluzione di reazione è guidata dalla convezione termica, che scambia continuamente alta e bassa temperatura in un microcanale a struttura anulare.L'intero processo di amplificazione può essere completato in 10 minuti con un limite di rilevamento di 70,5 pg/canale.
Come previsto, la PCR rapida è un potente strumento per la diagnostica molecolare e l'analisi multiplex della risposta del campione completamente integrati.Rapid PCR riduce significativamente il tempo necessario per rilevare SARS-CoV-2, che contribuisce al controllo efficace della pandemia di COVID-19.
La PCR richiede un termociclatore complesso che non è adatto per POCT.Più recentemente, le tecniche di amplificazione isotermica sono state applicate alla microfluidica, inclusa ma non limitata a LAMP, amplificazione della ricombinasi polimerasi (RPA) e amplificazione basata su sequenze di acidi nucleici [65,66,67,68].Con queste tecniche, gli acidi nucleici vengono amplificati a temperatura costante, facilitando la creazione di dispositivi POCT portatili a basso costo e altamente sensibili per la diagnostica molecolare.
I saggi LAMP basati su microfluidica ad alto rendimento consentono il rilevamento multiplo di malattie infettive [42, 69, 70, 71].In combinazione con un sistema microfluidico centrifugo, LAMP può ulteriormente facilitare l'automazione del rilevamento dell'acido nucleico [69, 72, 73, 74, 75].Lo SlipChip spin-and-react è stato sviluppato per il rilevamento visivo di più batteri paralleli utilizzando LAMP [76] (Fig. 4a).Quando si utilizzava LAMP ottimizzata nel test, il rapporto segnale-rumore della fluorescenza era di circa 5 volte e il limite di rilevamento raggiungeva 7,2 copie/μl di DNA genomico. Inoltre, l'esistenza di cinque comuni patogeni batterici digestivi, tra cui Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis e Vibrio parahaemolyticus, è stata visualizzata in base al metodo in < 60 min. Inoltre, l'esistenza di cinque comuni patogeni batterici digestivi, tra cui Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis e Vibrio parahaemolyticus, è stata visualizzata in base al metodo in < 60 min.Inoltre, la presenza di cinque comuni patogeni batterici del tubo digerente, tra cui Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis e Vibrio parahaemolyticus, è stata visualizzata utilizzando questo metodo in meno di 60 minuti.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 原体 的 存在 ， 包括 蜡状 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 沙门 氏 、 河流 弧菌 和 和 副溶血性 弧菌。。。。。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 ， ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPInoltre, la presenza di cinque comuni patogeni gastrointestinali batterici, tra cui Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius e Vibrio parahaemolyticus, è stata visualizzata utilizzando questo metodo in meno di 60 minuti.
I vantaggi di LAMP nella microfluidica includono, tra gli altri, una risposta rapida e un rilevamento miniaturizzato.Tuttavia, a causa della temperatura di reazione (intorno a 70°C), durante LAMP vengono inevitabilmente generati aerosol, con conseguente elevato tasso di falsi positivi.Anche la specificità del test, il design del primer e il controllo della temperatura devono essere ottimizzati per LAMP.Inoltre, i progetti di chip che implementano il rilevamento di più bersagli su un singolo chip sono di grande valore e dovrebbero essere sviluppati.Inoltre, LAMP è adatta per il rilevamento multiuso integrato in un chip, il che è di grande importanza, ma c'è ancora molto spazio per lo sviluppo.
L'alto tasso di falsi positivi di LAMP può essere parzialmente ridotto con RPA, poiché la temperatura di reazione relativamente bassa (~37 °C) provoca relativamente pochi problemi di evaporazione [77].Nel sistema RPA, due primer opposti avviano la sintesi del DNA legandosi a una ricombinasi e l'amplificazione può essere completata entro 10 minuti [78,79,80,81].Pertanto, l'intero processo RPA è molto più veloce di PCR o LAMP.Negli ultimi anni, la tecnologia microfluidica ha dimostrato di migliorare ulteriormente la velocità e l'accuratezza dell'RPA [82,83,84].Ad esempio, Liu et al.[85] hanno sviluppato un saggio di amplificazione della ricombinasi della polimerasi a flusso laterale integrato microfluidico per il rilevamento rapido e sensibile di SARS-CoV-2 integrando la trascrizione inversa RPA (RT-RPA) e un sistema di rilevamento universale delle strisce reattive a flusso laterale.in un unico sistema microfluidico.Figura 4b).Il limite di rilevamento è 1 copia/µl o 30 copie/campione e il rilevamento può essere completato in circa 30 minuti.Kong et al.hanno sviluppato un dispositivo microfluidico indossabile.[86] hanno utilizzato la temperatura corporea e un sistema di rilevamento della fluorescenza basato su telefono cellulare per rilevare rapidamente e direttamente il DNA dell'HIV-1 utilizzando l'RPA (Figura 4c).Il test RPA indossabile rileva 100 copie/mL della sequenza target entro 24 minuti, dimostrando un grande potenziale per una rapida diagnosi di neonati con infezione da HIV-1 in contesti con risorse limitate.
Amplificazione isotermica nei test point-of-care (POCT).Sviluppo e produzione di SlipChip di spin e reazione.Dopo la saldatura al plasma, i chip superiore e inferiore sono stati assemblati con una serie di dadi per formare il chip finale (adattato da [76]).b Schema del sistema MI-IF-RPA per il rilevamento di COVID-19 (adattato da [85]).c Schema di un test RPA indossabile per il rilevamento rapido del DNA dell'HIV-1 (adattato da [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carbossifluoresceina, virus dell'immunodeficienza umana HIV, amplificazione della ricombinasi polimerasi RPA, LED diodo a emissione di luce, MI-IF-RPA Microfluidica a flusso laterale integrato ricombinasi-polimerasi Amplificazione
L'RPA basato sulla microfluidica si sta sviluppando rapidamente, tuttavia, il costo di fabbricazione del chip e il consumo di reazione è troppo elevato e deve essere ridotto per aumentare la disponibilità di questa tecnologia.Inoltre, l'elevata sensibilità dell'RPA può influenzare l'amplificazione di prodotti non specifici, soprattutto in presenza di contaminazione.Queste limitazioni possono influenzare l'applicazione dell'RPA nei sistemi microfluidici e meritare un'ulteriore ottimizzazione.Sono necessari anche primer e sonde ben progettati per vari bersagli per migliorare la fattibilità delle strategie microfluidiche basate su RPA in POCT.
Cas13 e Cas12a hanno la capacità di scindere casualmente gli acidi nucleici e quindi possono essere sviluppati come strumenti di rilevamento e diagnostico.Cas13 e Cas12a vengono attivati ​​​​in seguito al legame con il DNA o l'RNA bersaglio, rispettivamente.Una volta attivata, la proteina inizia a fendere altri acidi nucleici vicini, dopodiché gli RNA guida che prendono di mira gli acidi nucleici specifici del patogeno possono fendere sonde fluorescenti spente e rilasciare fluorescenza.Sulla base di questa teoria, Kellner et al.[87] hanno sviluppato un metodo basato su Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)] e Broughton et al.[88] hanno sviluppato un altro approccio basato su Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting endonucleasi del DNA (DTECR)].
Negli ultimi anni sono comparsi vari metodi per la rilevazione degli acidi nucleici basati su CRISPR [89, 90].I metodi convenzionali basati su CRISPR sono spesso dispendiosi in termini di tempo e lavoro a causa di molteplici procedure tra cui l'estrazione, l'amplificazione e il rilevamento di CRISPR dell'acido nucleico.L'esposizione di liquidi all'aria può aumentare la possibilità di risultati falsi positivi.Dato quanto sopra, i sistemi basati su CRISPR hanno un disperato bisogno di ottimizzazione.
Una piattaforma microfluidica controllata pneumaticamente in grado di eseguire 24 analisi in parallelo è stata sviluppata per applicazioni di rilevamento CRISPR-Cas12a e CRISPR-Cas13a [91].Il sistema è dotato di un dispositivo di rilevamento della fluorescenza che bypassa l'amplificazione dell'acido nucleico e rileva automaticamente campioni di DNA e RNA femtomolari.Chen et al.[92] amplificazione integrata della ricombinasi con il sistema CRISPR-Cas12a in microfluidica centrifuga (Fig. 5a).Questo lavoro supera la difficoltà di integrare questi due processi perché Cas12a può digerire il DNA messaggero e inibire il processo di amplificazione.Inoltre, Chen et al.[92] hanno inoltre pre-immagazzinato i reagenti di reazione in un controllo microfluidico centrifugo per completare automaticamente l'intero processo.In un altro lavoro, Silva et al.[93] hanno sviluppato un metodo diagnostico senza amplificazione CRISPR/Cas12a e uno smartphone per rilevare SARS-CoV-2 (Fig. 5b).Questo test, noto come sistema privo di amplificazione basato su telefoni cellulari, include un enzima dipendente da CRISPR/Cas che si basa sulla visualizzazione da smartphone dei segnali di bolle generati dalla catalasi nei canali microfluidici.Rilevamento sensibile di meno di 50 copie/µl di acido nucleico senza preamplificazione, l'intero processo dall'iniezione del campione alla lettura del segnale richiede solo 71 minuti.
Metodi di rilevamento degli acidi nucleici basati su CRISPR.POCT centrifugo per la diagnostica molecolare integrata basata su CRISPR (adattato da [92]).b Sviluppo del test CASCADE per l'analisi basata su smartphone di SARS-CoV-2 (adattato da [93]).Amplificazione della ricombinasi RAA, motivo protospacer adiacente PAM, brevi ripetizioni palindromiche raggruppate CRISPR a intervalli regolari, sistema CASCADE senza amplificazione del telefono cellulare con enzimi CRISPR/CAS-dipendenti, 1-etil-3-[3-dimetilamminopropil] carbodiimmide cloridrato EDC
Come ultimo passaggio nel rilevamento dell'acido nucleico, il rilevamento del segnale riflette direttamente i risultati diagnostici ed è un fattore critico nello sviluppo di un POCT efficiente, sensibile e accurato.I segnali possono essere letti utilizzando vari metodi come strategie fluorescenti, elettrochimiche, colorimetriche e magnetiche.In questa sezione, descriviamo la logica di ciascun approccio e confrontiamo la diagnostica molecolare delle malattie infettive in microfluidica.
Le strategie basate sulla fluorescenza sono ampiamente utilizzate per la diagnostica POCT delle malattie infettive grazie ai loro notevoli vantaggi di eccellente sensibilità, basso costo, facilità d'uso e analisi point-of-care [94, 95].Queste strategie utilizzano fluorofori etichettati come coloranti fluorescenti e nanomateriali per creare un segnale rilevabile (aumento della fluorescenza o spegnimento).Questa scoperta suggerisce che le strategie basate sulla fluorescenza possono essere suddivise in etichettatura fluorescente diretta, rilevamento fluorescente signal-on e signal-off [96].Il rilevamento diretto di etichette fluorescenti utilizza speciali etichette fluorescenti per etichettare ligandi specifici che generano una specifica quantità di fluorescenza quando legati selettivamente a un target.Per il rilevamento della fluorescenza basata sul segnale, la qualità del segnale fluorescente è positivamente correlata all'entità dell'interesse.L'intensità della fluorescenza è trascurabile in assenza di un target ed è rilevabile quando è presente una quantità sufficiente di target.Al contrario, l'intensità della fluorescenza rilevata dalla fluorescenza "signal-off" è inversamente proporzionale alla quantità di target, raggiungendo inizialmente un valore massimo e decrescendo gradualmente man mano che il target viene allargato.Ad esempio, utilizzando il meccanismo di trans-clivaggio dipendente dal target CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] hanno sviluppato una nuova strategia di riconoscimento per rilevare gli RNA che bypassano direttamente la trascrizione inversa (Fig. 6a).Dopo essersi legato a RNA bersaglio complementari, il complesso CRISPR-Cas13-RNA può essere attivato, innescando la scissione transcollaterale da parte di RNA reporter non specifici.Il reporter fluorescente [fluoroforo (F)] viene spento dal quencher (Q) intatto e diventa fluorescente quando viene scisso dal complesso attivato.
Il vantaggio del rilevamento elettrochimico è l'elevata velocità di rilevamento, la facile produzione, il basso costo, il facile trasporto e il controllo automatico.È un potente metodo analitico per le applicazioni POCT.Basato su transistor ad effetto di campo in grafene Gao et al.[98] hanno sviluppato un nanobiosensore per il rilevamento multiplex degli antigeni della malattia di Lyme dai batteri Borrelia burgdorferi con un limite di rilevamento di 2 pg/mL (Fig. 6b).
I test colorimetrici sono stati utilizzati nelle applicazioni POCT, beneficiando dei vantaggi di portabilità, basso costo, facilità di preparazione e lettura visiva.Il rilevamento colorimetrico può utilizzare l'ossidazione di perossidasi o nanomateriali simili alla perossidasi, l'aggregazione di nanomateriali e l'aggiunta di coloranti indicatori per convertire le informazioni sulla presenza di acidi nucleici target in cambiamenti di colore visibili [99, 100, 101].In particolare, le nanoparticelle d'oro sono ampiamente utilizzate nello sviluppo di strategie colorimetriche e, grazie alla loro capacità di indurre cambiamenti di colore rapidi e significativi, c'è un crescente interesse per lo sviluppo di piattaforme colorimetriche POCT per la diagnosi in situ di malattie infettive [102].Con un dispositivo microfluidico centrifugo integrato [103], i patogeni di origine alimentare nei campioni di latte contaminato possono essere rilevati automaticamente a livello di 10 cellule batteriche e i risultati possono essere letti visivamente entro 65 minuti (Fig. 6c).
Le tecniche di rilevamento magnetico possono rilevare con precisione analiti utilizzando materiali magnetici e negli ultimi decenni c'è stato un notevole interesse per le applicazioni POCT.Le tecniche di rilevamento magnetico presentano alcuni vantaggi unici come materiali magnetici a basso costo piuttosto che costosi componenti ottici.Tuttavia, l'uso di un campo magnetico migliora l'efficienza di rilevamento e riduce il tempo di preparazione del campione [104].Inoltre, i risultati del sondaggio magnetico dimostrano un'elevata specificità, sensibilità e un elevato rapporto segnale-rumore a causa del segnale di fondo magnetico insignificante dei campioni biologici [105].Sharma et al.integrato un biosensore basato su giunzione a tunnel magnetico in una piattaforma di microchip portatile.[106] per il rilevamento multiplex di agenti patogeni (Fig. 6d).I biosensori rilevano in modo sensibile gli acidi nucleici subnanomolari isolati dai patogeni.
Tipico metodo di rilevamento del segnale.Il concetto di rilevamento iperlocalizzato di Cas13a (adattato da [97]).b Nanobiosensore di grafene FET in combinazione con Lyme GroES scFv (adattato da [98]).c Indicazioni colorimetriche per il rilevamento multiplex di agenti patogeni di origine alimentare in un chip microfluidico centrifugo: campioni n. 1 e n. 3 con patogeni target e campioni n. 2, n. 4 e n. 5 senza patogeni target (adattato da [103]) .d Biosensore basato su una giunzione a tunnel magnetico, comprendente una piattaforma, un amplificatore di blocco integrato, un'unità di controllo e un alimentatore per la generazione/acquisizione del segnale (adattato da [106]).GFET Grafene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polimetilmetacrilato
Nonostante le eccellenti caratteristiche dei metodi di rilevamento di cui sopra, presentano ancora degli svantaggi.Questi metodi vengono confrontati (tabella 1), comprese alcune applicazioni con dettagli (pro e contro).
Con lo sviluppo della microfluidica, dei sistemi microelettromeccanici, delle nanotecnologie e della scienza dei materiali, l'uso di chip microfluidici per il rilevamento di malattie infettive è in costante progresso [55,96,107,108].La manipolazione precisa di apparecchiature e fluidi in miniatura contribuisce all'accuratezza diagnostica e all'economicità.Pertanto, per un ulteriore sviluppo, sono stati compiuti sforzi per ottimizzare e aggiornare i chip, ottenendo vari chip microfluidici con strutture e funzioni diverse.Qui introduciamo brevemente diversi tipi comuni di piattaforme microfluidiche e ne confrontiamo le caratteristiche (pro e contro).Inoltre, la maggior parte degli esempi elencati di seguito si concentra principalmente sulla lotta contro SARS-CoV-2.
I LOCC sono i più comuni sistemi analitici complessi miniaturizzati e le loro operazioni sono altamente miniaturizzate, integrate, automatizzate e parallelizzate dall'iniezione e dalla preparazione del campione, dal controllo del flusso e dal rilevamento di liquidi [109, 110].I liquidi vengono manipolati attraverso una geometria accuratamente progettata e l'interazione di molti effetti fisici come gradienti di pressione, azione capillare, elettrodinamica, campi magnetici e onde acustiche [111].LOCC mostra eccellenti vantaggi nello screening ad alto rendimento e nel rilevamento multiplo, con velocità di analisi elevata, dimensioni ridotte del campione, basso consumo energetico ed elevata efficienza gestionale ed operativa;tuttavia, i dispositivi LOCC sono molto delicati e la produzione, il confezionamento e l'interfacciamento.Tuttavia, il multiplexing e il riutilizzo devono affrontare enormi difficoltà [96].Rispetto ad altre piattaforme, LOCC presenta vantaggi unici in termini di massima diversità di applicazioni e migliore compatibilità tecnologica, ma anche i suoi svantaggi sono evidenti, ovvero l'elevata complessità e la scarsa ripetibilità.La dipendenza da pompe esterne, spesso ingombranti e costose, ne limita ulteriormente l'utilizzo in POCT.
Durante l'epidemia di COVID-19, LOCC ha ricevuto molta attenzione.Allo stesso tempo, ci sono diversi nuovi chip che combinano diverse tecnologie.Ad esempio, gli smartphone sono ora ampiamente utilizzati come dispositivi di analisi portatili e hanno un grande potenziale per l'integrazione LOCC.Sole et al.[21] hanno fabbricato un chip microfluidico che consente di multiplexare specifiche sequenze di acidi nucleici di cinque agenti patogeni, incluso SARS-CoV-2, utilizzando LAMP e li hanno analizzati utilizzando uno smartphone entro 1 ora dalla fine della reazione.Come altro esempio, Sundah et al.[112] hanno creato un interruttore molecolare [amplificazione catalitica mediante interruttore dello stato di transizione molecolare (CATCH)] per il rilevamento diretto e sensibile di bersagli RNA SARS-CoV-2 utilizzando smartphone. CATCH è compatibile con LOCC portatile e raggiunge prestazioni superiori (circa 8 copie di RNA/μl; < 1 ora a temperatura ambiente) [112]. CATCH è compatibile con LOCC portatile e raggiunge prestazioni superiori (circa 8 copie di RNA/μl; < 1 ora a temperatura ambiente) [112]. Cattura свместим с портативны и оббеспечивает превосхо cercca CATCH è compatibile con LOCC portatile e fornisce un'eccellente produttività (circa 8 copie di RNA/µl; < 1 ora a temperatura ambiente) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 часа при комнатной температуре) [112]. CATCH è compatibile con LOCC portatili e ha prestazioni eccellenti (circa 8 copie di RNA/µl; < 1 ora a temperatura ambiente) [112].Inoltre, i dispositivi LOCC per la diagnostica molecolare utilizzano anche alcune forze motrici come il vuoto, lo stiramento e i campi elettrici.Kang et al.[113] hanno dimostrato una PCR nanoplasma-on-a-chip in tempo reale e ultraveloce per la diagnosi rapida e quantitativa di COVID-19 sul campo utilizzando un chip PCR liquido plasmonico sottovuoto.Li et al.[114] successivamente hanno sviluppato un chip microfluidico stretch-driven che ha consentito la diagnosi di COVID-19.La piattaforma utilizza il sistema di amplificazione RT-LAMP per determinare se un campione è qualitativamente positivo o negativo.Successivamente, Ramachandran et al.[115] hanno ottenuto gradienti di campo elettrico appropriati utilizzando l'isotacoforesi (ITP), una tecnica selettiva di focalizzazione ionica implementata in microfluidica.Con l'ITP, l'RNA bersaglio da campioni di tamponi nasofaringei grezzi può essere purificato automaticamente.Poi Ramachandran et al.[115] La combinazione di questa purificazione ITP con i test LAMP e CRISPR potenziati con ITP ha rilevato SARS-CoV-2 nel tampone nasofaringeo umano e nei campioni clinici in circa 35 minuti.Inoltre, nuove idee emergono costantemente.Jadhav et al.[116] hanno proposto uno schema diagnostico basato sulla spettroscopia Raman con superficie migliorata in combinazione con un dispositivo microfluidico contenente nanotubi di carbonio rivestiti in oro/argento orientati verticalmente o micro/nanotubi elettrofilati monouso.I microcanali del filtro incorporati funzionalizzati a membrana sono monouso.Il dispositivo assorbe i virus da vari fluidi corporei/essudazioni come saliva, rinofaringe e lacrime.Pertanto, il titolo del virus è abbondante e il virus può essere identificato con precisione dalla firma Raman.
LOAD è una piattaforma microfluidica centrifuga in cui tutti i processi sono controllati da un protocollo di frequenza che ruota un substrato microstrutturato [110].Il dispositivo LOAD è caratterizzato dall'utilizzo della forza centrifuga come importante forza motrice.I liquidi sono inoltre soggetti a forze capillari, di Eulero e di Coriolis.Utilizzando un dispositivo a centrifuga, le analisi vengono eseguite in funzionamento liquido continuo da una posizione radiale verso l'interno verso l'esterno, eliminando la necessità di ulteriori tubi esterni, pompe, attuatori e valvole attive.In breve, un unico metodo di controllo semplifica il funzionamento.Le forze che agiscono sul liquido nello stesso canale microfluidico alla stessa distanza dal centro di carico sono uguali, il che consente di ripetere la struttura del canale.Pertanto, le apparecchiature LOAD sono più semplici ed economiche da progettare e produrre rispetto alle apparecchiature LOCC convenzionali, mentre le reazioni sono ampiamente indipendenti e parallele;tuttavia, a causa dell'elevata resistenza meccanica delle apparecchiature centrifughe, il materiale del truciolo disponibile è limitato e i piccoli volumi sono difficili.alla macchina.Allo stesso tempo, la maggior parte dei dispositivi LOAD sono progettati per essere monouso, il che è costoso per il rilevamento su larga scala [96, 117, 118, 119].
Negli ultimi decenni, LOAD, considerato uno dei dispositivi microfluidici più promettenti, ha ricevuto notevole attenzione da parte di ricercatori e produttori.Pertanto, LOAD ha ottenuto un'ampia accettazione ed è stato utilizzato per la diagnostica molecolare di agenti patogeni infettivi [120, 121, 122, 123, 124], specialmente durante l'epidemia di COVID-19.Ad esempio, alla fine del 2020, Ji et al.[60] hanno dimostrato un test RT-qPCR diretto per il rilevamento parallelo rapido e automatizzato delle infezioni da SARS-CoV-2 e influenza A e B nei campioni di tampone faringeo.Quindi Xiong et al.[74] hanno presentato una piattaforma microfluidica discoide integrata con LAMP per il rilevamento rapido, accurato e simultaneo di sette coronavirus respiratori umani, incluso SARS-CoV-2, entro 40 minuti.All'inizio del 2021, de Oliveira et al.[73] hanno dimostrato un chip microfluidico centrifugo con toner in polistirene, azionato manualmente con un rotatore della punta delle dita, per la diagnosi molecolare RT-LAMP di COVID-19.Successivamente, Dignan et al.[39] hanno presentato un microdispositivo centrifugo portatile automatizzato per la purificazione dell'RNA SARS-CoV-2 direttamente dalle sezioni del tampone buccale.Medved et al.[53] hanno proposto un sistema di campionamento dell'aerosol SARS-CoV-2 in linea con un chip fluorescente microfluidico rotante di piccolo volume con un limite di rilevamento di 10 copie/μL e una soglia minima del ciclo di 15 minuti.Suarez et al.[75] hanno recentemente riportato lo sviluppo di una piattaforma microfluidica centrifuga modulare integrata per il rilevamento diretto dell'RNA SARS-CoV-2 in campioni di tampone nasofaringeo inattivati ​​al calore mediante LAMP.Questi esempi dimostrano i grandi vantaggi e la promessa di LOAD nella diagnostica molecolare di COVID-19.
Nel 1945 Muller e Clegg [125] presentarono per la prima volta i canali microfluidici su carta usando carta da filtro e paraffina.Nel 2007, il gruppo Whitesides [126] ha creato la prima piattaforma di carta funzionale per il test di proteine ​​e glucosio.La carta è diventata un substrato ideale per la microfluidica.La carta ha proprietà intrinseche come idrofilia e struttura porosa, eccellente biocompatibilità, leggerezza, flessibilità, piegabilità, basso costo, facilità d'uso e convenienza.I µPAD classici sono costituiti da strutture idrofile/idrofobiche costruite su substrati di carta.A seconda della struttura tridimensionale, i μPAD possono essere suddivisi in μPAD bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D).I µPAD 2D sono prodotti formando confini idrofobici per formare canali microfluidici, mentre i µPAD 3D sono solitamente costituiti da pile di strati di carta microfluidica 2D, a volte mediante piegatura della carta, tecniche di scorrimento, canali aperti e stampa 3D [96].I fluidi acquosi o biologici sul μPAD sono controllati principalmente dalla forza capillare senza una fonte di alimentazione esterna, facilitando la pre-conservazione dei reagenti, la manipolazione dei campioni e il rilevamento multiplex.Tuttavia, il controllo accurato del flusso e il rilevamento multiplex sono ostacolati da velocità di rilevamento, sensibilità e riutilizzabilità insufficienti [96, 127, 128, 129, 130].
In quanto piattaforma microfluidica insolita, μPAD è stato ampiamente promosso e sviluppato per la diagnosi molecolare di malattie infettive come HCV, HIV e SARS-CoV-2 [131, 132].Per il rilevamento selettivo e sensibile dell'HCV, Tengam et al.[133] hanno sviluppato un nuovo biosensore basato su carta fluorescente utilizzando una sonda di acido nucleico altamente specifica basata sul peptide pirrolidinilico.Gli acidi nucleici sono immobilizzati in modo covalente su carta di cellulosa parzialmente ossidata mediante alchilazione riduttiva tra gruppi amminici e gruppi aldeidici e il rilevamento si basa sulla fluorescenza.Questi segnali possono essere letti da un gadget appositamente realizzato con una fotocamera fluorescente portatile in combinazione con la fotocamera di un cellulare.Successivamente Lu et al.[134] hanno progettato un elettrodo flessibile a base di carta basato su nanoparticelle di nichel/oro/nanotubi di carbonio/compositi con struttura organometallica di alcol polivinilico per il rilevamento del bersaglio dell'HIV mediante ibridazione del DNA utilizzando il blu di metilene come indicatore redox del DNA.Più recentemente, Chowdury et al.[135] hanno presentato un progetto ipotetico di piattaforma per il test µPAD point-of-care utilizzando la saliva grezza del paziente in combinazione con LAMP e tecnologia di imaging portatile per il rilevamento dell'analita COVID-19.
I test di flusso laterale guidano i fluidi mediante forze capillari e controllano il movimento dei fluidi mediante la bagnabilità e le caratteristiche dei substrati porosi o microstrutturati.I dispositivi di flusso laterale sono costituiti da campioni, coniugato, incubatore e rilevamento e tamponi assorbenti.Le molecole di acido nucleico nell'LFA riconoscono leganti specifici che sono pre-immagazzinati nel sito di legame e si legano come complessi.Quando il liquido passa attraverso le piastre di incubazione e di rilevamento, i complessi vengono catturati dalle molecole di cattura situate sulle linee di test e di controllo, mostrando risultati che possono essere letti direttamente ad occhio nudo.In genere, LFA può essere completato in 2-15 minuti, il che è più veloce della scoperta tradizionale.A causa del meccanismo speciale, LFA richiede poche operazioni e non richiede attrezzature aggiuntive, il che lo rende molto facile da usare.È facile da produrre e miniaturizzare e il costo dei substrati a base di carta è inferiore.Tuttavia, viene utilizzato solo per l'analisi qualitativa e il rilevamento quantitativo è molto difficile e la capacità di multiplexing e il throughput sono molto limitati e può essere rilevato solo un acido nucleico sufficiente alla volta [96,110,127].
Sebbene la maggior parte delle applicazioni di LFA si concentrino sui test immunologici, anche l'uso di LFA per la diagnostica molecolare nei chip microfluidici è efficace e popolare [136].Nel caso del virus dell'epatite B, HIV e SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] hanno proposto una piattaforma LFA di nanoparticelle di up-conversion e hanno dimostrato la versatilità di questa piattaforma miniaturizzata e portatile attraverso il rilevamento sensibile e quantitativo di bersagli multipli come l'acido nucleico dell'HBV.Inoltre, Fu et al.[138] hanno dimostrato un nuovo LFA basato sulla spettroscopia Raman con superficie potenziata per l'analisi quantitativa del DNA dell'HIV-1 a basse concentrazioni.Per il rilevamento rapido e sensibile di SARS-CoV-2, Liu et al.[85] hanno sviluppato un'analisi del flusso laterale RPA integrata nella microfluidica combinando RT-RPA e un sistema di rilevamento del flusso laterale universale in un unico sistema microfluidico.
L'applicazione di varie piattaforme microfluidiche varia a seconda di studi specifici, sfruttando appieno le capacità e i vantaggi delle piattaforme.Con valvole, pompe e condotti convenienti, LOCC è la piattaforma più completa per la diversità delle applicazioni e l'interoperabilità con il più ampio spazio di sviluppo.Pertanto, ci auguriamo e raccomandiamo che gli studi più recenti siano condotti presso il LOCC come primo tentativo e che le condizioni siano ottimizzate.Inoltre, nel sistema dovrebbero essere scoperti e utilizzati metodi più efficienti e accurati.LOAD eccelle nel controllo preciso dei fluidi dai dispositivi LOCC esistenti e dimostra vantaggi esclusivi negli azionamenti singoli grazie alla forza centrifuga senza la necessità di azionamenti esterni, mentre le risposte parallele possono essere separate e sincronizzate.Pertanto, in futuro, LOAD diventerà la principale piattaforma microfluidica con meno operazioni manuali e tecnologie più mature e automatizzate.La piattaforma µPAD combina i vantaggi di LOCC e materiali cartacei per una diagnostica monouso a basso costo.Pertanto, lo sviluppo futuro dovrebbe concentrarsi su tecnologie convenienti e consolidate.Inoltre, l'LFA è adatto per il rilevamento a occhio nudo, promettendo di ridurre il consumo di campioni e accelerare il rilevamento.Un confronto dettagliato della piattaforma è mostrato nella Tabella 2.
Le analisi digitali dividono il campione in molti microreattori, ognuno dei quali contiene un numero discreto di molecole bersaglio [139, 140].I saggi digitali offrono vantaggi significativi per l'esecuzione della quantificazione assoluta eseguendo migliaia di esperimenti biochimici paralleli simultaneamente e individualmente in compartimenti su scala micron piuttosto che in una fase continua.Rispetto alla microfluidica tradizionale, le reazioni del compartimento possono ridurre il volume del campione, aumentare l'efficienza della reazione ed essere facilmente integrate con altri metodi analitici senza la necessità di canali, pompe, valvole e design compatti [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .I seguenti due metodi vengono utilizzati nei saggi digitali per ottenere una separazione uniforme e accurata delle soluzioni, inclusi reagenti e campioni come cellule, acidi nucleici e altre particelle o molecole: (1) emulsioni a goccia che sfruttano l'instabilità dell'interfaccia liquida;(2) la divisione dell'array è effettuata dai vincoli geometrici del dispositivo.Nel primo metodo, le goccioline contenenti reagenti e campioni in microcanali possono essere create con metodi passivi come co-corrente, flusso incrociato, focalizzazione del flusso, emulsionamento a fasi, emulsionamento a microcanali e membrane attraverso forze di taglio viscose ed emulsionamento con cambio di canale.localizzazione [143, 145, 146, 148, 149] o utilizzando metodi attivi [150, 151], che introducono energia aggiuntiva attraverso il controllo elettrico, magnetico, termico e meccanico.In quest'ultimo approccio, la migliore uniformità del volume del fluido nelle camere microfluidiche è condivisa dal mantenimento di strutture spaziali della stessa dimensione, come micropit e array di superficie [152,153,154].In particolare, le goccioline sono sezioni di flusso principali che possono anche essere generate e manipolate su array di elettrodi basati sulla microfluidica digitale (DMF).L'elettrowetting dei dielettrici è una delle teorie DMF meglio studiate, poiché l'elettrowetting dei dielettrici consente la manipolazione precisa delle singole gocce, controllando la forma del liquido e dei segnali elettrici asimmetrici che passano attraverso lati diversi [141, 144].Le operazioni principali con le goccioline in DMF includono lo smistamento, la scissione e la fusione [151, 155, 156], che possono essere applicate in vari campi di analisi, in particolare nel rilevamento molecolare [157, 158, 159].
Il rilevamento digitale dell'acido nucleico è una tecnologia diagnostica molecolare di terza generazione che segue la PCR convenzionale e la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR), in parallelo con il sequenziamento ad alto rendimento e la biopsia liquida.Negli ultimi due decenni, gli acidi nucleici digitali si sono sviluppati rapidamente nel campo della diagnostica molecolare dei patogeni infettivi [160, 161, 162].La quantificazione assoluta del rilevamento digitale dell'acido nucleico inizia con il confezionamento di campioni e reagenti in compartimenti individuali per garantire che ogni sequenza bersaglio abbia la stessa probabilità di entrare in ogni singolo compartimento.Teoricamente, a ciascuna sezione possono essere assegnate più sequenze target, oppure potrebbe non esserci un sistema di microreazione indipendente.Attraverso i vari meccanismi di rilevamento sopra descritti, i compartimenti con sequenze bersaglio microbiche che generano segnali al di sopra di una certa soglia possono essere visualizzati ad occhio nudo o da una macchina e sono etichettati come positivi, mentre altri compartimenti che generano segnali al di sotto della soglia sono etichettati come positivi .quelli negativi, che rendono il segnale per ogni sezione un booleano.Pertanto, calcolando il numero di compartimenti creati e il tasso di risultati positivi dopo la reazione, le copie originali dei campioni di prova possono essere abbinate utilizzando la formula di distribuzione di Poisson senza la necessità di una curva standard, richiesta per analisi quantitative di routine come come qPCR.[163] Rispetto ai metodi diagnostici molecolari tradizionali, il rilevamento digitale dell'acido nucleico ha un grado di automazione più elevato, una maggiore velocità e sensibilità di analisi, un minor numero di reagenti, una minore contaminazione e una progettazione e produzione più semplici.Per questi motivi, l'uso di saggi digitali, in particolare metodi basati su gocce, per la diagnostica molecolare, combinando tecniche di amplificazione e lettura del segnale, è stato ben studiato durante l'epidemia critica di SARS-CoV-2.Ad esempio, Yin et al.[164] metodi combinati di PCR digitale e veloce a goccia per rilevare i geni ORF1ab, N e RNasi P in SARS-CoV-2 in un chip microfluidico.In particolare, il sistema è stato in grado di identificare un segnale positivo entro 115 secondi, che è più veloce della PCR convenzionale, indicando la sua efficacia nel rilevamento point-of-care (Figura 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] e Alteri et al.[167] hanno anche applicato la PCR digitale a goccia (ddPCR) per rilevare SARS-CoV-2 in un sistema microfluidico con risultati impressionanti.Per migliorare ulteriormente il tasso di rilevamento, Shen et al.[168] ha ottenuto l'imaging del chip basato su ddPCR in appena 15 s senza l'uso di tecniche di cucitura dell'immagine, accelerando il processo della tecnologia ddPCR dal laboratorio all'applicazione.Non vengono applicati solo metodi di amplificazione termica come la PCR, ma vengono utilizzati anche metodi di amplificazione isotermica per semplificare le condizioni di reazione e una risposta rapida.Lu et al.[71] hanno sviluppato SlipChip per l'analisi delle goccioline, in grado di generare goccioline di varie dimensioni ad alta densità in un solo passaggio e quantificare gli acidi nucleici SARS-CoV-2 utilizzando LAMP digitale (Figura 7b).Essendo una tecnologia in rapida evoluzione, CRISPR può anche svolgere un ruolo importante nel rilevamento digitale dell'acido nucleico attraverso un comodo imaging colorimetrico senza la necessità di ulteriori colorazioni di acido nucleico.Ackerman et al.ha sviluppato una reazione a matrice combinatoria per la valutazione multiplex degli acidi nucleici.[158] hanno rilevato 169 virus associati all'uomo, incluso SARS-CoV-2, in goccioline contenenti reagenti per il rilevamento dell'acido nucleico a base di CRISPR-Cas13 in un saggio di micropozzetti (Figura 7c).Inoltre, l'amplificazione isotermica e la tecnologia CRISPR possono essere utilizzate nello stesso sistema per combinare i vantaggi di entrambi.Parco et al.[169] È stato sviluppato un test digitale CRISPR/Cas12a in un chip microfluidico commerciale per il rilevamento di SARS-CoV-2 estratto e ucciso dal calore basato su un RT-RPA a stadio singolo con un rilevamento segnale-sfondo più breve e più elevato rapporto di tempo., gamma dinamica più ampia e migliore sensibilità (Fig. 7d).Alcune descrizioni di questi esempi sono fornite nella Tabella 3.
Tipica piattaforma digitale per il rilevamento dell'acido nucleico.a Il flusso di lavoro della PCR digitale rapida consiste in quattro fasi chiave: preparazione del campione, distribuzione della miscela di reazione, processo di amplificazione e quantificazione del target (adattato da [164]).b Schema che mostra l'analisi delle goccioline SlipChip per la formazione di goccioline ad alta densità (adattato da [71]).c Diagramma del flusso di lavoro CARMEN-Cas13 (adattato da [158]).d Panoramica del rilevamento digitale avanzato dei virus con CRISPR/Cas in un unico contenitore (adattato da [169]).W/O acqua-in-olio, polidimetilsilossano PDMS, reazione a catena della polimerasi PCR, raccolta dati DAQ, derivato integrale proporzionale PID, reazione a matrice combinatoria CARMEN per valutazione multiplex dell'acido nucleico, SARS-CoV-2, sindrome respiratoria acuta grave, coronavirus 2, RT Amplificazione della trascrittasi inversa ricombinasi polimerasi-RPA, segnale S/B in background