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Ding Jingnuo, Zhao Weifeng, Dipartimento di Malattie Infettive, Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Suzhou, Città di Suzhou, Provincia di Jiangsu, 215000 tel.tumori dell'apparato digerente con una sopravvivenza globale a 5 anni del 14,1%.Molti pazienti con carcinoma epatocellulare vengono diagnosticati in uno stadio avanzato, quindi uno screening precoce è essenziale per ridurre la mortalità per carcinoma epatocellulare.Oltre agli indicatori di rilevamento comunemente usati come alfa-fetoproteina sierica (AFP), alfa-fetoproteina reattiva alla lectina del cristallino (AFP-L3) e protrombina anormale (proteina II indotta da carenza di vitamina K, PIVKA-II), tecniche di biopsia fluida È stato dimostrato che ha un valore diagnostico nella rilevazione dell'HCC.Rispetto alle procedure invasive, la biopsia del fluido può rilevare i metaboliti maligni circolanti.Le tecniche di biopsia fluida rilevano le cellule tumorali circolanti, il DNA tumorale circolante, l'RNA circolante e gli esosomi e sono utilizzate per lo screening precoce, la diagnosi e la valutazione prognostica dell'HCC.Questo articolo esamina la biologia molecolare e l'applicazione di varie tecniche di biopsia fluida per isolare biomarcatori promettenti che possono essere opzioni praticabili per la valutazione precoce dell'HCC per migliorare lo screening precoce dei gruppi di HCC ad alto rischio.Parole chiave: tecnica di biopsia fluida, carcinoma epatocellulare, gruppo ad alto rischio.
Il carcinoma epatocellulare (HCC) è un tumore maligno comune del tubo digerente, al sesto posto tra i nuovi casi di tumori maligni sia negli uomini che nelle donne.1 A livello mondiale, il cancro al fegato è la terza causa di morte per cancro dopo il cancro del polmone e del colon-retto, rappresentando l'8,3% dei decessi correlati al cancro per tutte le neoplasie maligne.1 La prognosi dell'HCC è strettamente correlata allo stadio alla diagnosi.Le ragioni principali della scarsa sopravvivenza nell'HCC sono le metastasi intraepatiche, i trombi tumorali venosi portale e le metastasi a distanza che precludono la resezione e molte di queste caratteristiche sono già presenti nei pazienti al momento della diagnosi.
Sulla base delle linee guida diagnostiche e terapeutiche, i principali fattori di rischio per lo sviluppo dell'HCC sono la cirrosi epatica, l'infezione da virus dell'epatite B cronica (HBV) o da virus dell'epatite C (HCV), la steatosi epatica alcolica e la steatosi epatica non alcolica (NAFLD). ).2 Inoltre, i fattori di rischio per l'HCC includono l'assunzione di cibo contaminato da aflatossine, la schistosomiasi, altre cause di cirrosi, una storia familiare di cancro al fegato, diabete, obesità, fumo e danno epatico indotto da farmaci.I gruppi ad alto rischio di 35 e 45 anni dovrebbero sottoporsi a controlli medici regolari.Lo screening precoce è un'importante strategia di trattamento precoce per migliorare la sopravvivenza globale dei pazienti con carcinoma epatocellulare.
I biomarcatori come AFP, AFP-L3 e PIVKA-II sono raccomandati per lo screening precoce di HCC3,4.Le tecniche di biopsia liquida hanno mostrato risultati promettenti nella diagnosi precoce e nella valutazione del trattamento.5,6 Sono stati compiuti progressi significativi nella biopsia liquida dell'HCC, che può avere una maggiore sensibilità e specificità rispetto ai marcatori sierici comunemente usati come l'AFP (Tabella 1).
L'AFP è un biomarcatore ampiamente utilizzato nell'HCC ed è attualmente il biomarcatore più dettagliato ampiamente utilizzato per lo screening precoce, la diagnosi e la valutazione della malattia.Un livello di AFP persistentemente elevato è considerato un fattore di rischio per la progressione dell'HCC.7,8 Il tasso di rilevamento del piccolo carcinoma epatocellulare (sHCC) sta aumentando con lo sviluppo degli ultrasuoni e della tomografia computerizzata e l'AFP è risultato particolarmente insensibile al rilevamento dell'hHCC nella pratica clinica.Secondo uno studio multicentrico retrospettivo9, l'AFP positivo è stato riscontrato nel 46% (616/1338) dei casi di HCC e nel 23,4% (150/641) dei casi di sHCC.Inoltre, i livelli di AFP sono elevati nei pazienti con malattia epatica cronica e cirrosi.10 Pertanto, l'AFP ha un effetto di screening limitato per sHCC.11 Secondo le Linee guida per la pratica clinica dell'Asia-Pacifico per il carcinoma epatocellulare, l'uso di AFP non è raccomandato.12 L'evidenza clinica suggerisce che PIVKA-II è superiore all'AFP nel trattamento dell'HCC e che la combinazione di PIVKA-II e AFP ha un valore diagnostico più elevato nell'HCC.13 Rispetto alla biopsia tissutale, la biopsia fluida rileva principalmente i metaboliti associati al tumore nei fluidi corporei (sangue, saliva, liquido pleurico, liquido cerebrospinale o urina) ed è meno invasiva per i tessuti.14 Inoltre, le biopsie liquide possono riflettere caratteristiche maligne non presenti nel tessuto tumorale primario.15 Le biopsie liquide non sono ancora state testate nella pratica clinica per tutti i tipi di tumori, ma il loro potenziale diagnostico nel cancro sta attirando l'attenzione degli oncologi.16 La biopsia del fluido può rilevare le cellule tumorali circolanti (CTC), il DNA tumorale circolante (cDNA), l'RNA libero circolante (ecRNA) e gli esosomi.In questo articolo, discuteremo le caratteristiche, il ruolo e l'applicazione di varie tecniche di biopsia fluida nello screening precoce di gruppi di carcinoma epatocellulare ad alto rischio.
Il DNA extracellulare (cfDNA) in campioni di sangue di individui sani è stato descritto per la prima volta nel 1948 da Mandel et al.17 cfDNA è un frammento di DNA libero da cellule di circa 160–180 bp di lunghezza, originato principalmente da linfociti e cellule mieloidi.Il ctDNA è uno specifico frammento di DNA mutante rilasciato dalle cellule tumorali nel sangue periferico, che rappresenta l'informazione genomica delle cellule tumorali dopo alcuni processi fisiopatologici, tra cui necrosi, apoptosi ed escrezione.La proporzione di ctDNA nel cfDNA totale varia ampiamente con il tipo di tumore e si dice che i frammenti di cDNA abbiano una lunghezza tipicamente inferiore a 167 bp.18 Lo studio di Underhill ha mostrato che i frammenti di cfDNA sono generalmente più corti del normale cfDNA.19 Rispetto agli individui sani, la lunghezza totale dei frammenti di cfDNA nel sangue dei pazienti oncologici è più breve, quindi il cfDNA può essere utilizzato come indicatore dello screening precoce del tumore.L'arricchimento di alcuni sottoinsiemi di lunghezze dei frammenti di cfDNA può migliorare il rilevamento del cDNA associato a tumori solidi non metastatici.Gli studi hanno dimostrato che il ctDNA si trova in oltre il 75% dei tumori avanzati del pancreas, del colon, della vescica, dell'apparato gastrointestinale, del fegato, delle ovaie, della mammella, del melanoma e della testa e del collo.20,21 Tuttavia, la quantità di ctDNA nel sangue dipende dalla posizione del tumore.22 In uno studio di Bettegoud, i pazienti con tumori del colon-retto, della mammella, del fegato, dei polmoni e della prostata hanno livelli più elevati di cDNA nel sangue rispetto ad altri tumori.Al contrario, nei pazienti con cancro orale, cancro del pancreas, cancro gastrico e glioma, la concentrazione di cDNA nel sangue era inferiore.ventuno
Poiché il ctDNA contiene le stesse mutazioni genetiche delle cellule tumorali primarie, il cDNA può essere utilizzato per rilevare mutazioni eterogenee specifiche del tumore e cambiamenti epigenetici, tra cui metilazione, idrossimetilazione, variazioni di singolo nucleotide e variazioni del numero di copie.ventitré
La metilazione del DNA è uno dei cambiamenti epigenetici più comuni con conseguente repressione genica.Rispetto alle cellule normali, ci sono differenze nel livello complessivo di metilazione del genoma delle cellule tumorali, specialmente nella metilazione dei geni oncosoppressori, che possono essere rilevati in una fase iniziale, suggerendo che i cambiamenti nella metilazione del DNA possono essere un indicatore di precoce rilevamento della tumorigenesi.I geni oncosoppressori associati all'HCC possono essere inattivati ​​dalla metilazione del promotore, stimolando così la tumorigenesi.24 La metilazione del DNA è un marker ideale per la diagnosi precoce dei tumori grazie alla sua specificità tissutale, rilevabilità e indipendenza dall'età.Inoltre, la metilazione del DNA è più comune rispetto alle mutazioni somatiche perché ci sono più regioni bersaglio e diversi siti CpG alterati in ciascuna regione del genoma bersaglio.25 Oltre a più siti CpG, un gran numero di loci ipermetilati indipendenti nel ctDNA è stato identificato in DBX2, THY1, MT1M, INK4A, VIM, FBLN1 e RGS10.26 Xu et al.Il confronto tra i campioni di cfDNA di 1098 pazienti con carcinoma epatocellulare e 835 controlli sani è stato riscontrato che i geni associati all'HCC sono fortemente correlati alle corrispondenti firme di metilazione del cDNA plasmatico.25 Sulla base di analisi di laboratorio, è stato sviluppato un modello predittivo contenente 10 marcatori di metilazione con sensibilità e specificità rispettivamente dell'85,7% e del 94,3%, e questi marcatori erano altamente correlati con la massa tumorale, lo stadio del tumore e la risposta al trattamento.Questi risultati indicano che l'uso dei marcatori di metilazione del cDNA è molto promettente nella diagnosi, nel monitoraggio e nella prognosi dell'HCC.In un modello di metilazione costituito da tre geni metilati in modo anomalo (APC, COX2, RASSF1A) e un miRNA (miR203) presentato da Lu et al27, la sensibilità e la specificità del modello 27 per la diagnosi dell'HCC associato all'HBV erano comparabili.80%.Inoltre, il modello potrebbe rilevare il 75% dei pazienti con carcinoma epatocellulare non diagnosticato con un livello di AFP di 20 ng/mL.Il gene per la proteina 1A della famiglia di dominio associata a Ras (RASSF1A) è la principale sequenza di DNA ripetitiva nel genoma umano.Arajo et al.ha concluso che l'ipermetilazione del promotore RASSF1A potrebbe essere un prezioso biomarcatore per lo screening precoce dell'HCC e un potenziale bersaglio molecolare per la terapia epigenetica.28 In uno studio, l'ipermetilazione sierica del promotore RASSF1A è stata riscontrata nel 73,3% dei pazienti con carcinoma epatocellulare.29 L'elemento nucleotidico 1 lungo intervallato (LINE-1) è un altro mediatore di retrotrasposizione altamente attivo.L'ipometilazione della LINE-1 è stata trovata nel DNA del 66,7% dei campioni di siero di HCC ed è stata associata a recidiva precoce e scarsa sopravvivenza dopo la resezione radicale.29 L'ipermetilazione è un processo genetico comune che svolge un ruolo unico nello sviluppo della cirrosi epatica e dell'HCC.30 Al contrario, l'idrossimetilazione è un processo di demetilazione che induce la riattivazione e l'espressione genica e la rilevazione del prodotto 5-idrossimetilcitosina (5-hmC) in questo processo può essere utilizzata per identificare un tumore.La metilazione e l'idrossimetilazione del cDNA sono associate alla tumorigenesi e possono contribuire allo screening precoce dell'HCC.In uno studio su 2554 soggetti, sono stati trovati 31 5-hmC a livello del genoma in campioni di cfDNA e 32 geni sono stati identificati confrontando sequenze di 5-hmC in pazienti con carcinoma epatocellulare e gruppi ad alto rischio come quelli con malattie croniche.Modelli diagnostici di malattie del fegato.e cirrosi.Questo modello era superiore all'AFP nel distinguere l'HCC dal tessuto non tumorale.
Le mutazioni nelle regioni codificanti possono portare ad anomalie trascrizionali, che possono portare a cambiamenti nelle sequenze proteiche e, infine, al cancro.Le varianti a singolo nucleotide sono importanti marcatori genomici per lo screening precoce del tumore grazie alla loro elevata affidabilità tissutale e all'elevata specificità tumorale e tissutale.Numerosi studi relativi all'HCC che utilizzano il sequenziamento di nuova generazione (NGS) per il sequenziamento dell'esoma e dell'intero genoma del cancro hanno identificato geni cellulari mutati comuni come TP53 e CTNNB1, oltre a molti tra cui ARID1A, MLL, IRF2.I nuovi geni, ATM, CDKN2A, FGF19, PIK3CA, RPS6KA3 e JAK1 mostrano tassi di mutazione moderati. L'analisi della funzione del gene mutante suggerisce che le alterazioni nel rimodellamento della cromatina, nella trasduzione del segnale Wnt/β-catenina e JAK/STAT, nella via del ciclo cellulare P53, nei modificatori epigenetici, nelle vie dello stress ossidativo, nella via PI3K/AKT/MTOR e nella via RAS/RAF/ La via della chinasi MAPK svolge ruoli cruciali nell'oncogenesi dell'HCC.32,33 In uno studio in cui sono state rilevate mutazioni associate al tumore, Huang et al hanno scoperto che la frequenza delle mutazioni associate al tumore dipendenti dal ctDNA era del 19,5% e la specificità era del 90% .34 Inoltre, i pazienti che hanno subito un'invasione vascolare avevano maggiori probabilità di avere mutazioni del ctDNA (P=0,041) e una sopravvivenza libera da recidiva più breve (P<0,001). L'analisi della funzione del gene mutante suggerisce che le alterazioni nel rimodellamento della cromatina, nella trasduzione del segnale Wnt/β-catenina e JAK/STAT, nella via del ciclo cellulare P53, nei modificatori epigenetici, nelle vie dello stress ossidativo, nella via PI3K/AKT/MTOR e nella via RAS/RAF/ La via della chinasi MAPK svolge ruoli cruciali nell'oncogenesi dell'HCC.32,33 In uno studio in cui sono state rilevate mutazioni associate al tumore, Huang et al hanno scoperto che la frequenza delle mutazioni associate al tumore dipendenti dal ctDNA era del 19,5% e la specificità era del 90% .34 Inoltre, i pazienti che hanno subito un'invasione vascolare avevano maggiori probabilità di avere mutazioni del ctDNA (P=0,041) e una sopravvivenza libera da recidiva più breve (P<0,001).L'analisi della funzione del gene mutante suggerisce che i cambiamenti nel rimodellamento della cromatina, nella segnalazione Wnt/β-catenina e JAK/STAT, nella via del ciclo cellulare P53, nei modificatori epigenetici, nelle vie dello stress ossidativo, nella via PI3K/AKT/MTOR e nella via della chinasi RAS/RAF/MAPK un ruolo critico nella tumorigenesi dell'HCC.32,33 In uno studio che ha trovato mutazioni associate al tumore, Huang et al.hanno scoperto che la frequenza delle mutazioni associate al tumore dipendenti dal ctDNA era del 19,5% e la specificità era del 90%..34 Кроме того, у пациентов с сосудистой инвазией чаще встречались мутации цДНК (P=0,041) и более короткая безрецидивная выживаемость (P<0,001). .34 Inoltre, i pazienti con invasione vascolare avevano più mutazioni del cDNA (P=0,041) e una sopravvivenza libera da malattia più breve (P<0,001).L'analisi funzionale dei geni mutanti ha rivelato il rimodellamento della cromatina, la segnalazione Wnt/β-catenina e JAK/STAT, la via del ciclo cellulare P53, i modificatori epigenetici, la via dello stress ossidativo, la via PI3K/AKT/MTOR e la via RAS/RAF/MAPK la via della chinasi gioca un ruolo fondamentale nell'oncogenesi dell'HCC. 32,33 在 一 项 检测 到 肿瘤 相关 突变 的 研究 ， ， Huang 等 人 发现 肿瘤 相关 突变 依赖于 ctDNA 的 频率 为 19,5% ， 特异性 90% .34 此外 ， 经历 经历 血管 的 患者 更 更 有 发生 发生 发生 发生 发生 发生 可能 可能 可能 可能 可能 可能 可能 可能 可能 可能 可能 可能 可能 可能 可能 可能 tivamente突变（P=0.041）和更短的无复发生存期（P<0.001）。 32.33 在 一 项 检测 到 相关 突变 的 研究 ， Huang 等 发现 肿瘤 相关 突变 依赖于 ctDNA 的 为 为 19,5% ， 特异性 90% .34 此外 经历 血管 侵犯 的 更 更 可能 发生 ctDNA 突变 （P = 0.041） 和 和 更短的无复发生存期（P<0.001）。32,33 In uno studio che ha trovato mutazioni associate al tumore, Huang et al.hanno scoperto che le mutazioni associate al tumore dipendevano per il 19,5% dal cDNA con una specificità del 90% 34. Inoltre, i pazienti che avevano subito un'invasione vascolare avevano maggiori probabilità di sviluppare cDNA.мутация (P = 0,041) e более короткая безрецидивная выживаемость (P <0,001). mutazione (P=0,041) e sopravvivenza libera da malattia più breve (P<0,001).Un altro gene driver HCC comune è TP53, che ha un tasso di mutazione di oltre il 30%.Gli studi hanno dimostrato che la frequenza delle mutazioni di TP53 nel ctDNA nel sangue e nelle urine varia dal 5% al ​​60%.35 Lo studio di Johan ha mostrato che lo spettro di mutazioni del ctDNA nell'HCC tardivo ha un tasso di mutazione simile all'HCC iniziale, incluso il promotore TERT (51%), TP53 (32%), CTNNB1 (17%), PTEN (8%), mutazioni in AXIN1 ., ARID2, KMT2D e TSC2 (6% ciascuno).36 L'oncogene β-catenina (CTNNB1) gioca un ruolo importante nella via di segnalazione Wnt.Il coattivatore della trascrizione CTNNB1 può promuovere l'espressione genica, che può portare alla proliferazione cellulare, all'inibizione dell'apoptosi e all'angiogenesi.CTNNB1 può anche interagire con TERT per indurre la trasformazione degli epatociti.33 Il promotore TERT è frequentemente mutato in alcuni tumori solidi.Le alterazioni di TERT, uno dei primi cambiamenti genetici nella trasformazione maligna dell'HCC, possono portare alla riattivazione della telomerasi negli epatociti cirrotici e possono promuovere la proliferazione e prevenire l'invecchiamento.Mutazioni nel promotore 33-37 TERT sono state riportate nel 59-90% dei pazienti con noduli epatici proliferativi e carcinoma epatocellulare precoce e sono associate alla sopravvivenza.38
Le modifiche al numero di copie (CNA) sono un importante sottotipo di mutazioni somatiche.La ricerca ha dimostrato che il carico diffuso e focale del CNA è una firma genomica in grado di predire l'infiltrazione immunitaria e l'esclusione del tumore in alcuni tipi di cancro.39 Segnalazione attiva di infiltrazione, elevata attività citolitica, grave infiammazione e marcatori genetici associati alla presentazione dell'antigene nell'HCC.L'analisi della matrice di dati dei polimorfismi a singolo nucleotide in 477 soggetti ha rivelato un basso carico sul SNC.Al contrario, i tumori cromosomicamente instabili con un elevato carico di CNA esteso hanno mostrato segni di rigetto immunitario ed erano associati a proliferazione, riparazione del DNA e disfunzione del TP53.Xu et al.ha mostrato che il gruppo HCC aveva punteggi CNA più alti rispetto al gruppo con malattia epatica cronica.40 Utilizzando il sequenziamento dell'intero genoma di una singola cellula, è stato riscontrato che i CNA compaiono all'inizio dell'epatocarcinogenesi e rimangono relativamente stabili durante la progressione del tumore.41 Chung et al.hanno scoperto che i livelli di cfDNA erano significativamente elevati nei pazienti con carcinoma epatocellulare e che i CNA dell'intero genoma nel cfDNA erano un importante marker prognostico indipendente nei pazienti con carcinoma epatocellulare trattati con sorafenib.42 I pazienti con un carico di CNA più elevato avevano più probabilità di avere progressione della malattia e morte rispetto a quelli con un carico di CNA inferiore.Ollerich et al.scoperto che l'indice di instabilità del numero di copie (CNI) può essere utilizzato per valutare il CNA nel cfDNA dei malati di cancro.Hanno notato che i pazienti con cancro avanzato avevano punteggi CNI significativamente più alti rispetto a un gruppo di controllo, che valuta la risposta del paziente alla chemioterapia e all'immunoterapia sistemiche.43 Questi risultati suggeriscono che i CNA trovati nei campioni bioptici liquidi possono servire come indicatori prognostici nei pazienti con cancro avanzato.HCC sullo sfondo della terapia sistemica.
Attualmente, i metodi utilizzati per rilevare il ctDNA possono essere suddivisi in metodi mirati e non mirati.In breve, metodi mirati come la reazione a catena della polimerasi digitale (dPCR), BEAMing digital PCR, Amplification Refractory Mutation System-PCR, Capp-Seq e Tam-Seq sono altamente sensibili ai geni predefiniti.I metodi fuori bersaglio come il sequenziamento dell'intero genoma e NGS forniscono una visione completa dell'intero panorama genomico.44 Rispetto ai pannelli target, il sequenziamento dell'intero genoma può rilevare non solo mutazioni puntiformi e inserzioni, ma anche riarrangiamenti e variazioni del numero di copie.prognosi e CTC e cfDNA sono buoni indicatori che possono essere utilizzati per il monitoraggio dinamico dell'HCC.45 Inoltre, l'analisi del cfDNA può essere più utile per rilevare l'HCC.Yan et al.ha mostrato che il cfDNA nel plasma dei pazienti con HCC era significativamente più alto rispetto ai pazienti con fibrosi epatica e controlli sani.Rispetto all'AFP, si prevede che il ctDNA sia un miglior marcatore di screening per l'HCC precoce.46 In uno studio prospettico di 47 biopsie liquide che hanno testato cfDNA e proteine ​​in una popolazione di popolazione, si è dimostrato efficace nel differenziare i pazienti con HCC dai pazienti senza HCC.In un follow-up di 331 pazienti ecografici normali e AFP-negativi, la sensibilità e la specificità del cfDNA per la diagnosi dell'HCC erano rispettivamente del 100% e del 94%, quindi il cDNA potrebbe rilevare l'HCC in individui sieropositivi HBsAg asintomatici.Nello studio Yeo48, è stata riscontrata un'alta frequenza (92,5%) di ipermetilazione del promotore RASSF1A in pazienti con carcinoma epatocellulare.Inoltre, Xu et al.ha creato un modello diagnostico per prevedere l'HCC utilizzando un pannello di marcatori di metilazione specifici con una specificità e una sensibilità rispettivamente del 90,5% e dell'83,3%.Il pannello consente di distinguere i pazienti con HCC dai pazienti con altre malattie del fegato, il che è migliore dell'AFP.Hanno anche scoperto che i normali controlli risultati positivi possono avere fattori di rischio per l'HCC, come l'infezione da HBV o una storia di consumo di alcol.25 Ipotizziamo che fattori ad alto rischio per l'HCC possano promuovere l'ipermetilazione del cfDNA, che quindi contribuisce alla progressione dell'HCC, e quindi il cfDNA potrebbe svolgere un ruolo chiave nello screening per i gruppi ad alto rischio.Cai et al.riassumere l'intera gamma di mutazioni del ctDNA e offrire una solida strategia per valutare il carico tumorale nei pazienti.49 Questa strategia può identificare la tumorigenesi una mediana di 4,6 mesi prima del cambiamento dell'imaging e ha mostrato prestazioni diagnostiche superiori rispetto ai biomarcatori sierici AFP, AFP-L3 e PIVKA-II.Il valore diagnostico del test del cDNA è stato dimostrato quando la valutazione dell'immagine non è disponibile, quindi il test del cDNA è utile nella diagnosi dell'HCC precoce nei gruppi ad alto rischio.Di recente, gli scienziati hanno utilizzato la tecnologia NGS per analizzare gli indicatori della variazione genetica multivariata (tra cui 5-idrossimetilcitosina, 5′-motivo, frammentazione, traccia di nucleosomi, HIFI) in 3204 campioni clinici e cfDNA.50 I modelli HIFI rivalidati con tre treni, test e set di test indipendenti hanno mostrato una discriminazione stabile e affidabile tra popolazioni HCC e non HCC con una sensibilità del 95,79% e 95,42% rispettivamente nei test e set di test specifici per HCC.I sessi erano rispettivamente del 95,00% e del 97,83%.Il valore diagnostico del metodo HIFI è superiore a quello dell'AFP nel distinguere l'HCC dalla cirrosi.Inoltre, il ctDNA viene utilizzato anche nel trattamento chirurgico.Atsushi et al.determinato i livelli sierici preoperatori di ctDNA nei pazienti con HCC e ha scoperto che il tasso di recidiva e il tasso di metastasi extraepatiche nel gruppo cDNA positivo erano significativamente più alti rispetto al gruppo cDNA negativo e i livelli di cDNA erano significativamente correlati.con progressione del tumore.51 Essendo un biomarcatore altamente sensibile, il ctDNA può predire la capacità dell'HCC di invadere i vasi.Wang et al.ha eseguito il sequenziamento dell'intero genoma di 46 pazienti con carcinoma epatocellulare e l'analisi multivariata ha mostrato che il valore soglia della frequenza allelica della variante cDNA per l'invasione nei microvasi è 0,83%, sensibilità 89,7% e specificità 80,0%.un fattore di rischio indipendente per l'invasione microvascolare nell'HCC resecabile, suggerendo che il cDNA può aiutare a guidare un trattamento ottimale.In conclusione, il ctDNA è pienamente implicato nell'insorgenza e nello sviluppo dell'HCC e può essere utilizzato per lo screening precoce, la valutazione chirurgica e il monitoraggio della malattia.
Le CTC sono cellule maligne derivate da tumori primari o metastasi che metastatizzano nel flusso sanguigno.Le cellule tumorali secernono metalloproteinasi della matrice (MMP), che distruggono la membrana basale, consentendo alle cellule tumorali di entrare direttamente nei vasi sanguigni e linfatici.Tuttavia, la maggior parte delle CTC viene rapidamente eliminata da anoikis, attacchi immunitari o stress da taglio.53 La transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) consente alle CTC di essere facilmente isolate dal tessuto tumorale primario, invadere i capillari e acquisire sopravvivenza, metastasi, invasività e resistenza ai farmaci significativamente migliorate.Gli studi hanno dimostrato che esiste una profonda eterogeneità tra le varie cellule tumorali nei tumori metastatici primari.Pertanto, l'analisi CTC può portare a una comprensione completa dell'eterogeneità delle cellule tumorali.54
I marcatori specifici per le CTC associate all'HCC includono il glipicano-3 (GPC3), il recettore dell'asialoglicoproteina (ASGPR), la molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM) e i marcatori associati alle cellule staminali come CD44, CD90, 55 e la molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM1).) .56 Il marcatore GPC3 è una proteina ancorata alla membrana cellulare che viene utilizzata clinicamente per l'analisi patologica e la caratterizzazione dell'HCC.57 L'espressione di GPC3 è più comune nelle cellule tumorali HCC con differenziazione intermedia e bassa e promuove la migrazione extraepatica;inoltre, la presenza di CTC GPC3+ indica un carcinoma epatocellulare metastatico.58 L'ASGPR è una proteina transmembrana espressa solo sulla superficie degli epatociti ed è altamente espressa nell'HCC ben differenziato.EpCAM è una delle proteine ​​associate alla membrana più comunemente utilizzate per catturare le CTC.EpCAM è stato identificato come un marcatore di superficie delle cellule HCC con caratteristiche delle cellule staminali,59 che è correlato a varie caratteristiche clinicopatologiche dell'HCC, come l'invasione vascolare, i livelli di AFP valutati e lo stadio avanzato del cancro al fegato presso l'Ospedale di Barcellona (BCLC).Il fenotipo EMT 60 CTC è altamente metastatico.54 I processi EMT nella CTC promuovono la metastasi dell'HCC.L'espressione di marcatori EMT come vimentina, torsione, E-box zinc finger binding (ZEB) 1, ZEB2, lumaca, lumaca ed E-caderina è stata studiata in CTC derivati ​​​​dal fegato da pazienti con HCC.58 Il sistema CanPatrol™ sviluppato da Cheng [61] ha classificato le CTC in tre sottogruppi fenotipici basati su marcatori prevalentemente espressi: fenotipo epiteliale (EpCAM, CK8/18/19), fenotipo mesenchimale (vimentina, a spirale) e fenotipi misti.In 176 pazienti, la CTC totale era superiore all'AFP nel differenziare l'HCC dalla malattia epatica benigna.I valori AUC per CTC totale, AFP e CTC e AFP totali combinati erano 0,774 (IC 95%, 0,704–0,834), 0,669 (IC 95%, 0,587–0,750) e 0,821 (IC 95%, 0,756–0,886 ).), rispettivamente.La classificazione CTC basata sull'EMT può predire la diagnosi di HCC, la recidiva precoce, le metastasi e un tempo complessivo più breve.
Attualmente, i metodi per rilevare le CSC includono metodi fisici e metodi biologici.I metodi fisici, spesso indicati come arricchimento basato su proprietà biofisiche, dipendono principalmente dalle proprietà fisiche delle CSC, come dimensioni, densità, carica, mobilità e deformabilità.A seconda delle proprietà fisiche, esistono vari metodi come sistemi basati sulla filtrazione, dielettroforesi, ecc. Quest'ultimo, noto anche come arricchimento basato sull'immunoaffinità, si basa principalmente sul legame antigene-anticorpo poiché il metodo utilizza anticorpi contro biomarcatori tumore-specifici come EpCAM, ASGPR, recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2), antigene prostatico specifico (PSA), pancitocheratina umana (P-CK) e carbamoilfosfato sintasi 1 (CPS1).62 Un altro tipo, chiamato metodo senza arricchimento, utilizza la citometria a flusso per differenziare le CTC dai leucociti in base a un rapporto ea una dimensione nucleo-citoplasmatico più elevati.Attualmente, l'unico test approvato dalla FDA per il rilevamento delle CTC è il sistema Cell-Search™, che utilizza il marcatore di superficie cellulare EpCAM. Tuttavia, il rilevamento CTC basato su marcatori combinati potrebbe aumentare il tasso di positività.54 Una miscela di anticorpi contro ASGPR e CPS1 ha raggiunto un tasso di rilevamento CTC del 91% nei pazienti con HCC.63 Zhang et al hanno utilizzato un chip CTC con anticorpi contro ASGPR, P -CK e CPS1, e ha differenziato i pazienti con carcinoma epatico da quelli con malattia epatica benigna o cancro non-HCC a un tasso del 100%.64 Uno studio di Wang ha rilevato CTC EpCAM+ nel 60% di 42 pazienti con carcinoma epatico e ha trovato correlazioni significative tra entrambe le positività tasso e il numero di CTC con stadio TNM.65 Guo et al hanno scoperto che un punteggio PCR derivato da CTC era elevato in 125/171 (73%) pazienti il ​​cui livello di AFP era <20 ng/mL con una sensibilità del 72,5% e un specificità del 95,0%, rispetto al 57,0% e al 90,0% per l'AFP a un cutoff di 20 ng/mL.66 La combinazione di AFP e CTC può migliorare il rilevamento dell'HCC.45 Si ritiene che i CTC abbiano un vantaggio rispetto all'AFP nello screening precoce dei gruppi ad alto rischio per HCC. Tuttavia, il rilevamento CTC basato su marcatori combinati potrebbe aumentare il tasso di positività.54 Una miscela di anticorpi contro ASGPR e CPS1 ha raggiunto un tasso di rilevamento CTC del 91% nei pazienti con HCC.63 Zhang et al hanno utilizzato un chip CTC con anticorpi contro ASGPR, P -CK e CPS1, e ha differenziato i pazienti con carcinoma epatico da quelli con malattia epatica benigna o cancro non-HCC a un tasso del 100%.64 Uno studio di Wang ha rilevato CTC EpCAM+ nel 60% di 42 pazienti con carcinoma epatico e ha trovato correlazioni significative tra entrambe le positività tasso e il numero di CTC con stadio TNM.65 Guo et al hanno scoperto che un punteggio PCR derivato da CTC era elevato in 125/171 (73%) pazienti il ​​cui livello di AFP era <20 ng/mL con una sensibilità del 72,5% e un specificità del 95,0%, rispetto al 57,0% e al 90,0% per l'AFP a un cutoff di 20 ng/mL.66 La combinazione di AFP e CTC può migliorare il rilevamento dell'HCC.45 Si ritiene che i CTC abbiano un vantaggio rispetto all'AFP nello screening precoce dei gruppi ad alto rischio di HCC.Tuttavia, la rilevazione combinata delle CTC basata sui marcatori può aumentare la percentuale di risultati positivi.54 Una miscela di anticorpi anti-ASGPR e CPS1 ha raggiunto un tasso di rilevazione delle CTC del 91% nei pazienti con HCC.63 Zhang et al.ha utilizzato un chip CTC con anticorpi contro ASGPR, P-CK e CPS1 e ha anche distinto i pazienti con HCC da quelli con malattia epatica benigna o non HCC a un tasso del 100%.частота и количество ЦОК со стадией TNM.65 Guo и соавторы обнаружили, что показатель ПЦР, полученный из ЦОК, был повышен у 125/171 (73%) пациентов, у которых уровень АФП был <20 нг/мл с чувствительностью 72,5% и специфичность 95,0% по сравнению с 57,0% и 90,0% для АФП при пороговом уровне 20 нг/мл.66 Комбинация АФП и ЦОК может улучшить обнаружение ГЦК.45 Считается, что ЦОК имеют преимущество перед АФП при раннем скрининге групп. frequenza e numero di CTC con stadio TNM.65 Guo et al hanno scoperto che la PCR derivata da CTC era elevata in 125/171 (73%) pazienti che avevano livelli di AFP <20 ng/mL con una sensibilità del 72,5% e una specificità di 95,0% rispetto al 57,0% e al 90,0% per l'AFP a un livello di cut-off di 20 ng/mL.66 La combinazione di AFP e CTC può migliorare la rilevazione dell'HCC.45 Si ritiene che le CTC presentino un vantaggio rispetto all'AFP nello screening precoce gruppi.ad alto rischio di carcinoma epatocellulare.Tuttavia, il rilevamento combinato delle CTC basato sui marcatori può aumentare la percentuale di risultati positivi.54 Una miscela di anticorpi anti-ASGPR e CPS1 ha raggiunto un tasso di rilevamento delle CTC del 91% nei pazienti con carcinoma epatocellulare.63 Zhang et al.ha utilizzato chip CTC con anticorpi contro ASGPR, P-CK e CPS1 e ha distinto i pazienti con HCC da malattie epatiche benigne e non HCC con il 100%.64 Lo studio di Wang ha identificato il 60% delle CTC EpCAM+ in 42 pazienti con carcinoma epatocellulare e ha riscontrato una correlazione significativa tra incidenza e numero di CTC allo stadio TNM. 65 GUO 等 人 发现 ， 在 AFP 水平 <20 ng/ml 的 125/171 (73%) 名 患者 中 ， CTC 衍生 的 PCR 评分 升高 ， 敏感性 72,5%， 特异性 为 95,0%， 而 AFP 在 在 截止值为20 ng/mL 时的特异性为 57.0% 和90.0%。 65 GUO 等 人 发现 在 在 在 水平 <20 ng/ml 的 125/171 (73%) 名 患者 ， ， CTC 衍生 PCR 评分 ， 敏感性 为 72,5%， 为 95,0%， AFP 在 截止 截止 截止 截止 截止 截止截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止 截止值 为 20ng/ml 时 的 特异性 57,0% 和 90,0%。65 Guo et al.обнаружили, что у 125/171 (73%) пациентов с уровнем АФП <20 нг/мл показатели ПЦР, полученные с помощью ЦОК, были повышены с чувствительностью 72,5% и специфичностью 95,0%, в то время как АФП на уровне отсечки Специфичность составляла 20 нг/мл. hanno riscontrato che in 125/171 (73%) pazienti con livelli di AFP <20 ng/mL, i valori di PCR derivati ​​dalle CTC erano elevati con una sensibilità del 72,5% e una specificità del 95,0%, mentre l'AFP era alla specificità del cut-off era 20 ng/ml.ml era 57,0% e 90,0%.66 La combinazione di ORP e CTC migliora il rilevamento dell'HCC.Si ritiene che 45 CTC siano superiori all'AFP nello screening precoce delle popolazioni di HCC ad alto rischio.Pertanto, per i gruppi HCC CTC positivi e ad alto rischio, il test CTC dovrebbe essere combinato di routine con il rilevamento di ultrasuoni e AFP.Tuttavia, le CTC sono considerate importanti predittori di metastasi e recidiva del tumore e il rilevamento delle CTC non è raccomandato in modo indipendente come strumento diagnostico.62 Pertanto, il CTC può fungere da biomarcatore predittivo migliore rispetto ad altri marcatori attualmente utilizzati. Zhou et al hanno scoperto che i pazienti con un numero elevato di CTC EpCAM+ e cellule T regolatorie mostravano un rischio maggiore di sviluppare recidiva di HCC, rispetto a quelli con un numero basso di CTC, con un rapporto di recidiva del 66,7% vs 10,3% (P <0,001).67 Uno studio simile è stato riportato da Zhong et al.68 Inoltre, Qi ha rilevato che 101 su 112 pazienti (90,81%) con HCC, compresi quelli con malattia in stadio iniziale, erano positivi per CTC e che erano stati rilevati noduli di HCC molto piccoli dopo 3 a 5 mesi di follow-up. Zhou et al hanno scoperto che i pazienti con un numero elevato di CTC EpCAM+ e cellule T regolatorie mostravano un rischio maggiore di sviluppare recidiva di HCC rispetto a quelli con un numero basso di CTC, con un rapporto di recidiva del 66,7% vs 10,3% (P <0,001).67 A studio simile è stato riportato da Zhong et al.68 Inoltre, Qi ha riscontrato che 101 su 112 pazienti (90,81%) con carcinoma epatocellulare, compresi quelli con malattia in stadio iniziale, erano positivi per le CTC e che noduli di carcinoma epatocellulare molto piccoli sono stati rilevati dopo 3 a 5 mesi di follow-up. Чжоу и др.обнаружили, что у пациентов с повышенным количеством ЦОК EpCAM+ и регуляторных Т-клеток риск развития рецидива ГЦК был выше, чем у пациентов с низким количеством ЦОК, с коэффициентом рецидивов 66,7% против 10,3% (P <0,001)67. Zhou et al hanno scoperto che i pazienti con CTC EpCAM+ elevati e cellule T regolatorie avevano un rischio maggiore di recidiva di HCC rispetto a quelli con CTC bassi, con un tasso di recidiva del 66,7% vs 10,3% (P<0,001)67.Uno studio simile è stato condotto da Zhong et al.68. Inoltre, Qi ha riscontrato che 101 su 112 pazienti (90,81%) con carcinoma epatocellulare, compresi quelli con malattia precoce, presentavano CTC e che noduli di carcinoma epatocellulare molto piccoli sono stati rilevati dopo 3-5 mesi di follow-up. ZHOU 等 人 发现 ， 与 CTC 数量 较 少 患者 相比 ， EPCAM+ CTC 和 调节性 T 细胞 数量 升高 的 患者 发生 HCC 复发 的 更 高 ， ， 复发率 分别 为 66,7% 和 10,3% (P <0,001)。 Zhou 等 人 发现 与 与 ctc 数量 少 的 患者 ， Epcam+ ctc 和 t 细胞 数量 的 患者 发生 hcc 复发 风险 更 ， 复发率 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 复发率 复发率 分别 分别 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 tivamente p <0.001)。。。。。。。。。。。。。。。 Чжоу и др.обнаружили, что пациенты с повышенным количеством ЦОК EpCAM+ и регуляторных Т-клеток имели более высокий риск рецидива ГЦК по сравнению с пациентами с меньшим количеством ЦОК, с частотой рецидивов 66,7% и 10,3% соответственно (P <0,001). Zhou et al.hanno scoperto che i pazienti con CTC EpCAM+ elevati e cellule T regolatorie avevano un rischio maggiore di recidiva di HCC rispetto ai pazienti con un minor numero di CTC, con tassi di recidiva rispettivamente del 66,7% e del 10,3% (P <0,001).Uno studio simile è stato riportato da Zhong et al.68 Inoltre, Qi ha riscontrato che 101 su 112 pazienti con carcinoma epatocellulare (90,81%), compresi i pazienti con malattia in fase iniziale, avevano risultati CTC positivi e dopo 3 visite hanno riscontrato noduli di carcinoma epatocellulare molto piccoli.Osservazione fino a 5 mesi.Hanno anche trovato CTC in 12 pazienti con infezione cronica da HBV e piccoli tumori HCC entro 5 mesi in 2 pazienti CTC-positivi.69 Pertanto, le CTC possono essere utilizzate per predire l'HCC, 70 ma possono essere utilizzate più regolarmente come biomarcatori predittivi.
Come il cfDNA, il cfRNA viene rilasciato nel flusso sanguigno attraverso vari sistemi.Queste molecole nel sangue periferico rappresentano il tessuto canceroso di origine.Rispetto ai marcatori rilevati con metodi non invasivi, i cfRNA sono regolati in modo più dinamico, specifici del tessuto e abbondanti nell'ambiente extracellulare.Il significato e il valore diagnostico di 71 miRNA (miRNA) nell'HCC sono stati riportati in molti studi.I miRNA sono RNA endogeni non codificanti (ncRNA) che regolano varie attività biologiche molecolari inibendo la traduzione degli RNA messaggeri target (mRNA).I miRNA si trovano in corpi apoptotici incapsulati negli esosomi, ma possono anche legarsi stabilmente alle proteine ​​sieriche e ai lipidi nel sangue periferico e possono essere usati per valutare l'HCC.I microRNA sono coinvolti nella rigenerazione epatica, nel metabolismo lipidico, nell'apoptosi, nell'infiammazione e nello sviluppo dell'HCC.72 I miRNA oncogenici come miR-21, miR-155 e miR-221 sono ben noti nell'HCC.In particolare, il miR-21 svolge un ruolo chiave nella sintesi del collagene nella matrice extracellulare e nella fibrosi e promuove l'epatocarcinogenesi attivando le cellule staminali ematopoietiche.72,73 I miRNA soppressori tumorali nell'HCC includono miRNA-122, miRNA-29, la famiglia Let-7 e la famiglia miRNA-15.La famiglia Let-7 è composta da molti miRNA oncosoppressori che prendono di mira la famiglia RAS.La famiglia miR-15 include miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-195 e miR-497, che hanno sequenze complementari per alcuni mRNA.Inoltre, anche gli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) e gli RNA circolari (cirRNA) sono importanti per lo screening precoce dell'HCC.Gli lncRNA rappresentano la classe più ampia di ncRNA, inclusi gli ncRNA simili a mRNA, e sono coinvolti nella patogenesi di molte malattie umane.Gli LncRNA svolgono un ruolo regolatorio nel microambiente epatico e nelle malattie epatiche croniche.74 I CircRNA sono anche una classe di ncRNA con molteplici funzioni nella regolazione dell'espressione genica.Recentemente, i circRNA sono stati considerati strumenti diagnostici per l'HCC.
L'RNA libero circolante ha una notevole stabilità, inclusa la resistenza alla temperatura, al pH e all'RNasi, il che rende l'isolamento dell'fnRNA dal sangue periferico meno noioso utilizzando i metodi di purificazione dell'RNA standard.I metodi più comunemente usati includono NGS, microarray e RT-qPCR.NGS consente di misurare i microRNA in tutto il genoma.Tuttavia, questo metodo è costoso e l'analisi non è standardizzata.Al contrario, RT-qPCR è poco costoso, amplifica rapidamente gli acidi nucleici e offre molti vantaggi come una maggiore sensibilità, una maggiore precisione, una gamma dinamica più ampia e richiede un minor numero di campioni.I microarray sono un altro metodo utilizzato per il rilevamento di miRNA basato sull'ibridazione sensibile e specifica di miRNA target con sonde di DNA complementari, 75 ma l'analisi dei dati di microarray richiede molto tempo.
È stato segnalato che miR-122 e Let-7 circolanti sono potenzialmente utili nella diagnosi di carcinoma epatocellulare allo stadio iniziale in gruppi ad alto rischio, marcatori nei pazienti con noduli premaligni associati all'HBV e carcinoma epatocellulare allo stadio iniziale.76 Cai et al.hanno scoperto che i membri della famiglia Let-7 (miR-92, miR-122, miR-125b, miR-143, miR-192, miR-16, miR-126 e miR-199a/b) sono a rischio cronico HCC nei pazienti con epatite.La famiglia Let-7 può fungere da efficace biomarcatore surrogato per predire lo sviluppo di HCC in gruppi ad alto rischio associati all'epatite cronica C. 77 miR-122 ha un'elevata accuratezza diagnostica nel rilevare l'HCC precoce nei pazienti con cirrosi epatica.78 Anche il MiR-107 circolante nel siero è stato valutato nelle prime fasi dell'HCC, 79 e ha mostrato un buon potenziale nelle popolazioni ad alto rischio.Zhou et al hanno riferito che un pannello di miRNA (miR-122, miR-192, miR-21, miR-223, miR-26a, miR-27a e miR-801) può differenziare l'HCC dall'epatite cronica B (CHB) e dalla cirrosi la sensibilità era rispettivamente del 79,1% e del 75% e la specificità del 76,4% e del 91,1%.80 Nell'HCC correlato all'HBV, abbiamo riscontrato che i livelli di miR150 erano significativamente ridotti rispetto a quelli dei pazienti con HBV cronico senza HCC (sensibilità 79,1%, specificità 76,5%).-224 era elevato nell'HCC rispetto ai controlli sani e le analisi dei sottogruppi hanno mostrato livelli più elevati nei pazienti con HCC associato a HBV.i pazienti con cirrosi associata all'epatite B e HCC hanno identificato un classificatore siRNA contenente sette siRNA differenzialmente espressi in grado di rilevare l'HCC in diversi controlli;L'intervallo di AUC allo screening precoce è migliore rispetto ai volontari AFP.Hanno scoperto che quattro miRNA (miR-1972, miR-193a-5p, miR-214-3p e miR-365a-3p) potevano distinguere i pazienti con HCC dai pazienti senza HCC.Cinque miRNA sovraesprimono (miR-122-5p, miR-125b-5p, miR-885-5p, miR-100-5p e miR-148a-3p) sono considerati potenziali infezioni da HBV in biomarcatori HCC, cirrosi e CHB, in particolare miR-34a-5p può essere biomarcatori per la cirrosi epatica,85 e possono essere potenziali biomarcatori per lo screening precoce dell'HCC nelle popolazioni ad alto rischio.L'lncRNA più studiato nell'HCC è altamente attivato nel cancro del fegato (HULC).Altri studi hanno dimostrato che l'HULC circolante nei pazienti con HCC può essere utilizzato come marker diagnostico perché questo lncRNA è altamente sovraregolato nei pazienti con HCC rispetto agli individui sani.71,86 Tra gli altri lnRNA, LINC00152 è considerato il miglior lncRNA diagnostico grazie alla sua elevata AUC, sensibilità e specificità.86 In uno studio, l'espressione nel sangue periferico di LINC00152 è aumentata gradualmente dai normali controlli sani ai pazienti con CHB e cirrosi, e infine era più alta in HCC.Gli studi sull'espressione di circSMARCA5 nel plasma di pazienti con carcinoma epatocellulare hanno mostrato un progressivo declino dell'espressione di carcinoma epatocellulare che va dall'epatite alla cirrosi e alle lesioni precancerose.87 L'analisi delle curve ROC ha confermato il potenziale di questi circRNA nel distinguere i pazienti con epatite o cirrosi epatica da quelli con HCC, in particolare quelli con livelli di AFP inferiori a 200 ng/mL.Inoltre, Zhu ha analizzato 13.617 RNA ciclici in campioni di plasma di pazienti con carcinoma epatocellulare associato all'HBV e ha confermato che 6 RNA ciclici erano espressi in modo diverso nell'HCC e nella cirrosi associata all'HBV, suggerendo che i cRNA potrebbero essere utili.marcatori per lo screening precoce di gruppi ad alto rischio come quelli associati a malattie del fegato, pazienti con sclerosi.88
Gli esosomi sono vescicole di membrana con un diametro di 40–160 nm;più vescicole intracellulari si fondono con la membrana cellulare e vengono rilasciate nella matrice extracellulare.Contengono molti componenti attivi, inclusi lipidi, proteine, RNA e DNA, e svolgono un ruolo chiave nella comunicazione tra le cellule, sia cellule HCC che non HCC.89,90 Gli esosomi regolano la progressione dell'HCC attivando i fibroblasti degli epatociti e le cellule stellate, le cellule immunitarie, gli epatociti normali e le cellule dell'HCC.91 Nel microambiente tumorale, le cellule tumorali producono un gran numero di esosomi che vengono trasportati dalle cellule tumorali alle cellule immature, che a loro volta sono coinvolte nell'oncogenesi, nella degradazione e nella segnalazione cellulare.92 Gli studi hanno dimostrato che gli esosomi possono trasferire oncogeni alle cellule normali durante i processi patologici, che possono essere uno dei meccanismi di invasione e metastasi del tumore.93 Il ruolo degli esosomi nella progressione del cancro può essere dinamico e specifico del tipo di cancro, 89 Gli esosomi possono essere interiorizzati da cellule adiacenti o distanti per regolare più geni bersaglio nelle cellule riceventi che possono essere coinvolti nella comunicazione intercellulare ioni e nelle interazioni del microambiente cellulare, possono mediare la segnalazione cellulare e il metabolismo.94 Le caratteristiche e i cambiamenti dinamici delle molecole di carico degli esosomi riflettono direttamente le caratteristiche e i cambiamenti dinamici delle cellule tumorali dei genitori,95 che è anche la base per l'uso degli esosomi nella diagnosi e nella prognosi del cancro, nonché per predire la risposta individuale alla terapia antitumorale ..96
I metodi di laboratorio tradizionali per l'isolamento e l'analisi degli esosomi sono complessi, in più fasi e richiedono molto tempo, tra cui ultracentrifugazione, filtrazione, cromatografia ad esclusione dimensionale, purificazione per immunoaffinità, Western blotting, saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), PCR e analisi del flusso.sistemi miniaturizzati e piattaforme lab-on-a-chip che utilizzano micro/nanotecnologia sono ampiamente sviluppati per l'isolamento in situ veloce e conveniente degli esosomi.L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è un metodo ampiamente utilizzato per caratterizzare le dimensioni e la concentrazione degli esosomi, inclusi metodi come nanoparticelle magnetiche e poliidrossialcanoati.I metodi microfluidici ed elettrochimici possono anche rilevare rapidamente gli esosomi con rese elevate.
Le proteine ​​esosomiali sono marcatori importanti per la diagnosi di carcinoma epatocellulare.Nello studio Arbelaiz, il livello della proteina legante 98 RasGAP SH3 (G3BP) e del recettore dell'immunoglobulina polimerica (PIGR) era significativamente elevato negli esosomi derivati ​​​​da HCC e l'efficacia combinata presunta delle due proteine ​​era superiore a quella dell'AFP.Il sovraccarico di ferro è un fattore importante che contribuisce allo sviluppo dell'HCC.Tseng ha riferito che l'epcidina può svolgere un ruolo chiave nella resistenza all'HCC.99 Gli esosomi derivati ​​dal siero di pazienti con carcinoma epatocellulare avevano un numero di copie significativamente maggiore di varianti dell'mRNA dell'epcidina rispetto alle loro controparti sane, suggerendo che l'epcidina potrebbe essere un nuovo biomarcatore diagnostico per l'HCC.La proteina 14-3-3ζ negli esosomi prodotti da 100 HCC può ridurre l'attivazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule T e può indurre la trasformazione delle cellule T in cellule T regolatorie, con conseguente esaurimento delle cellule T.101 Ciò è supportato da diversi studi che indagano sull'evasione del tumore dalla sorveglianza immunitaria, 102 che possono contribuire alla tumorigenesi dell'HCC.
Oltre alla presenza di ecRNA nel plasma o nel siero, gli esosomi arricchiti con RNA possono essere utilizzati per la stadiazione non invasiva in tempo reale nello screening precoce del tumore e per determinare l'evoluzione del tumore e la risposta alla terapia.Il livello di miRNA-21 esosomiale nel siero del sangue nel gruppo HCC era 2,21 volte superiore rispetto al gruppo CHB e nel gruppo HCC era 5,57 volte superiore rispetto alla popolazione sana.Nello studio Wang, gli esosomi hanno aumentato significativamente l'HCC rispetto ai pazienti cirrotici con valori di AUC di 0,83 (IC 95% 0,74–0,93) e 0,94 (IC 95% 0,88–1,00).104 I dati ottenuti hanno chiarito il coinvolgimento di specifiche molecole di carico esosomiali nella regolazione dell'oncogenesi e nella progressione dell'HCC.105 L'espressione sierica di miR-221, miR-103, miR-181c, miR-181a, miR-93 e miR-26a è coerente.e metastasi, e i livelli di miR21 erano molto più alti nei pazienti con HCC rispetto ai controlli sani e anche nei pazienti con CHB.102 LncRNA aveva un potenziale valore diagnostico nell'HCC.Gli studi hanno dimostrato che gli esosomi derivati ​​dal siero di pazienti con HCC hanno livelli significativamente più elevati di LINC00161, LINC000635 e lncRNA attivati ​​trasformando il fattore di crescita-β rispetto ai pazienti senza HCC e questi lncRNA sono fortemente associati allo stadio del TNM e al volume del tumore.110 Conigliaro et al.È stato scoperto che gli esosomi CD90 + esprimono alti livelli di lncRNAH19, che ha aumentato significativamente il rilascio del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e la produzione del recettore VEGF-R1, stimolando così l'angiogenesi.93 I circRNA sono un altro tipo di ncRNA esosomiale: espressi a livelli inferiori ma stabili tra le specie, i circRNA mostrano anche specificità per tipo cellulare, tipo di tessuto, stadio di sviluppo e attività regolatoria.111 circRNA sono biomarcatori diagnostici per il cancro precoce e minimamente invasivo.112 Recenti studi clinici hanno dimostrato che la specificità dei singoli miRNA nel predire l'HCC non è l'ideale.Pertanto, la rilevazione complessa mediante saggi multipli (ad es. miR-122 e miR-48a in combinazione con AFP) può migliorare l'identificazione dell'HCC precoce e la differenziazione dell'HCC dalla cirrosi.100
I pazienti con CHB e cirrosi epatica sono il gruppo ad alto rischio più comune di sviluppare HCC.Per i gruppi ad alto rischio, una volta ottenuta una risposta virologica sostenuta, dovrebbe essere sviluppata una strategia di sorveglianza economicamente vantaggiosa basata sul rischio di HCC e lo screening precoce è la chiave per migliorare la diagnosi e il trattamento dell'HCC con un elevato rapporto costo-efficacia2 ..I metodi di screening precoci per il cancro hanno molti limiti: metodi di screening precoci efficaci non sono stati sviluppati per la maggior parte dei tipi di cancro e l'aderenza è generalmente bassa.Rispetto ai tradizionali metodi di screening precoce, la tecnologia della biopsia liquida presenta evidenti vantaggi: facilità di campionamento, rilevamento del panrac, buona riproducibilità del campione e risposta efficace all'eterogeneità del tumore.Data l'efficacia in termini di costi dei metodi associati alla biopsia liquida, il loro uso nello screening dell'HCC non è stato testato di routine.Nonostante i progressi nel rilevamento accurato a livello molecolare, la biopsia fluida è costosa per rilevare l'HCC nei pazienti target, limitandone l'uso diffuso rispetto a procedure di imaging specifiche come l'ecografia e la risonanza magnetica.113,114 Tuttavia, uno studio precedente ha mostrato che la biopsia liquida ha mostrato un beneficio significativo in termini di anni di vita aggiustati per la qualità (QALY).115 Sono stati anche mostrati i benefici della biopsia liquida nel carcinoma precoce dello stomaco e del rinofaringe.116,117 L'opinione attuale è che la biopsia liquida possa integrare i biomarcatori sierici e lo screening radiologico nell'individuazione e nella diagnosi dei tumori.117 118
Secondo la letteratura attuale, la tecnologia della biopsia dei fluidi ha mostrato una sensibilità e una specificità significativamente più elevate nello screening precoce dei gruppi ad alto rischio di cancro al fegato.Indipendentemente dal tipo di biopsia del fluido, può distinguere l'HCC da individui ad alto rischio senza HCC, suggerendo l'importanza di uno screening precoce poiché le differenze tra individui ad alto rischio e sani sono evidenti.Il ctDNA ha una breve emivita e può essere utilizzato per rilevare l'HCC, quindi qualsiasi cambiamento nel cDNA derivato dal tumore può fornire prove concrete in tempo reale della progressione del tumore, specialmente per i piccoli tumori.Un livello elevato di ctDNA indica lo sviluppo e la diffusione del cancro ed è un indicatore precoce di progressione e recidiva.Inoltre, sulla base dei risultati del ctDNA, i pazienti possono ricevere un trattamento individualizzato e un follow-up.119 Siti di metilazione specifici possono essere un marcatore migliore dell'AFP per l'identificazione precoce di HCC e noduli cirrotici.Nei casi resecabili di carcinoma epatocellulare, livelli elevati di cDNA sono indicativi di invasione microvascolare e recidiva postoperatoria e metastasi.Le modifiche al numero di copie sono associate alla sopravvivenza dei pazienti con carcinoma epatocellulare.Si può presumere che la valutazione del cDNA possa essere coinvolta nel trattamento generale dell'HCC e che il cDNA possa fungere da indicatore efficace della modulazione terapeutica.Marcatori basati su specifiche mutazioni genetiche nel ctDNA sono stati adottati dalle linee guida cliniche per predire l'efficacia e monitorare la resistenza ai farmaci.Il test del ctDNA può essere lo strumento di biopsia liquida più utile per lo screening precoce.Le CTC svolgono anche un ruolo chiave nello screening precoce dei gruppi di carcinoma epatocellulare ad alto rischio.Vari marcatori di CTC associati all'HCC sono di particolare importanza nell'insorgenza, nello sviluppo e nella recidiva dell'HCC.Come vescicole di membrana, gli esosomi sono coinvolti nelle comunicazioni intercellulari, specialmente nelle cellule HCC.I microRNA circolanti sono stabili nel sangue e quindi possono essere più utili per lo screening precoce dell'HCC.A poco a poco, sono state scoperte proteine ​​esosomiali ed esosomi ricchi di RNA e la loro efficacia predittiva per l'HCC è stata confermata.È interessante notare che diverse eziologie di HCC possono anche essere associate a diverse mutazioni, quindi possiamo selezionare diversi biomarcatori per lo screening precoce in base a diverse eziologie di HCC.120
Tuttavia, le attuali tecniche di biopsia fluida sono discutibili in termini di stabilità e non possono eseguire autonomamente lo screening o il monitoraggio precoci dell'HCC, ma possono comunque integrare lo screening e la diagnosi individuali.121 Come forma di biopsia liquida, il rilevamento e l'imaging di ctDNA, CTC, cfRNA e AFP o PIVKA-II associati all'esosoma hanno applicazioni promettenti nella diagnosi precoce e nella prognosi dell'HCC.Tuttavia, l'esatto meccanismo di rilascio del ctDNA nel sangue resta da chiarire.Rivelando le proprietà biologiche di base del ctDNA può facilitarne l'uso come marcatore.La piccola quantità di ctDNA nella circolazione e i severi requisiti di manipolazione dei campioni sono sfide per l'implementazione clinica del rilevamento del cDNA nell'HCC.Inoltre, le mutazioni genetiche non hanno caratteristiche specifiche che consentano un'accurata identificazione degli agenti cancerogeni.Poiché molteplici varianti genetiche e somatiche sono presenti anche nei tessuti normali, le mutazioni genetiche identificate dalla biopsia del fluido possono essere di utilità limitata nello screening precoce per l'HCC.122 I limiti di target genici e biomarcatori utili ben definiti che aiutano a differenziare il cDNA dal DNA non tumorale sono le questioni più importanti nell'uso del cDNA.mancanza di utilità di marcatori sensibili e specifici per la rilevazione delle CTC.Sono state trovate solo cellule vitali con potenziale metastatico e la combinazione ottimale di marcatori arricchiti con CSC non era chiara.Anche l'isolamento delle CTC per la coltura e la valutazione dei loro profili mutazionali è un compito impegnativo.A causa di problemi con l'identificazione, l'isolamento e la purificazione degli esosomi, il meccanismo molecolare specifico non è ancora chiaro e studi precedenti sul meccanismo degli esosomi e dell'HCC non sono stati approfonditi e il modo in cui i miRNA, gli lncRNA e le proteine ​​​​vengono ordinati in esosomi , e non è chiaro se l'assorbimento dell'esosoma sia un processo di tipo specifico.L'uso degli esosomi per la diagnosi e il trattamento dell'HCC è ancora allo stadio preclinico.La mancanza di standardizzazione delle procedure di biopsia liquida, come il tipo di provette utilizzate per raccogliere il sangue, il volume del sangue, la conservazione e il rilevamento dei campioni, l'isolamento e l'arricchimento, può precluderne l'uso nella pratica clinica di routine a causa delle differenze nelle pratiche tra i centri medici.L'efficacia della biopsia liquida nello screening precoce, nella diagnosi, nella valutazione dell'efficacia e nella previsione dell'HCC resta da esplorare, specialmente per i gruppi ad alto rischio.La tecnologia della biopsia liquida ha un grande potenziale e si prevede che sarà ampiamente utilizzata nella pratica clinica del cancro al fegato nel prossimo futuro.
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